실험 Q&A Cell Biology > Transfection
안녕하세요, hek293에 transfection 효율 관련 질문드립니다.
레벨1 alsgh9712 (대학생)
안녕하세요, 현재 hek293-cas9 세포주에 gfp가 달린 sgRNA expression vector를 transfection하는 실험을 진행하고 있습니다. FACS로 봤을 때 2번의 실험이 모두 25%정도 efficiency를 보이고 있어 efficiency를 높이는 방법을 찾고 있습니다...
세포주는 본 실험을 위해 ATCC사에서 새로 구매한 세포주를 passage 3-5정도로 풀어서 사용하고 있고요. transfection reagent은 lipofectamine 3000을 사용하고 있습니다.
6well에 90%정도 confluency일 때 실험을 진행하고 있고 serum-free media에 24시간 두면 세포가 많이 죽어버려서 현재 serum starvation 없이 진행하고 있습니다.
lipofectamine과 DNA를 처리하기 전에 기존 cell media를 새로운 media(DMEM+10%FBS)로 교체하고, opti-mem에 담겨있는 incuation된 lipofectamine+DNA complex를 처리하고 있습니다.
이후 4h에 세포 상태를 한번 보고, 문제가 없으면 media 24h에 새 media(DMEM+10%FBS)로 교체, 이후 3~4day정도에 facs로 transfection된 세포를 얻고 있습니다.
sgRNA plasmid는 나노드랍 장비로 purity check시 순도가 높은 것을 확인하였고 plasmid농도는 1ug/ul의 농도로 실험하고 있습니다.
transfection 후 형광현미경으로 확인 시 transfection 효율이 높아보이진 않았는데, 역시 FACS로 측정해보니 약 25~30%정도의 효율을 보이고 있는 것 같습니다. hek293은 transfection이 잘되는 세포로 알고 있는데, 뭔가 제 실험에 문제가 있는 것 같다는 생각이 강하게 듭니다...
혹시 제가 진행하고 있는 프로토콜에서 개선할 수 있는 방법을 조언해주실 수 있으신가요?
감사합니다.
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