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- 항체 문제는 없나요?
- Ponceau S 염색했더니 밴드 염색이 보이지 않았기 때문이다
: lane 당 몇ug의 단백질을 loading했나요?
- 4도에서 overnight 시도했는데 shaker가 오류 떴다.
: 냉장고에 넣어서 shaking 안해도 O/N하면 잘 붙습니다.
- washing을 너무 많이 했다
: 단백질이 안 떨어집니다.
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레벨3
아스널
(대학원생)
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22.07.14 00:31
1. 항체 문제는 없나요?
-> primary antibody는 저의 전임자가 5월에 사용했을 때는 문제가 없었습니다. primary antibody는 5% BSA in 1X TBS-T에 희석해서 사용했습니다.
2. Ponceau S 염색했더니 밴드 염색이 보이지 않았기 때문이다.
: lane 당 몇ug의 단백질을 loading했나요?
-> lane 당 100 ug 단백질을 loading 했습니다. cell lysate는 -80도 보관된 것을 사용했습니다. ice에서 녹인 후, 100도에서 heat inactivation 시켰습니다. 남은 단백질은 -20도에 보관했습니다. 한번에 cell lysis부터 BCA assay까지하면 좋겠으나 하루에 웨스턴블롯 말고도 다른 실험도 있다보니....ㅠㅠ
3. 4도에서 overnight 시도했는데 shaker가 오류 떴다.
: 냉장고에 넣어서 shaking 안해도 O/N하면 잘 붙습니다.
-> 그렇군요. 감사합니다!
4. washing을 너무 많이 했다
: 단백질이 안 떨어집니다.
-> 단백질이 수용성이라서 떨어질 줄 알았어요. 감사합니다.
추가질문) 10% APS를 -20도 냉동보관한 것을 썼는데 얼어있지 않았습니다. 저는 얼려지지않은 것을 그대로 썼는데 그게 문제일까요? 8% SDS-PADE gel을 만들어서 사용합니다.
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지나가다
(비회원)
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22.07.14 08:26
secondary는 제대로 쓰셨나요?
일반적으로 흔히 쓰이는 anti-mouse인지 anti-rabbit인지도 확인하시고
HRP conjugated antibody 쓴 건 맞는지 확인하시구요.
marker가 일단 찍혔다는 걸 봐서는 transfer가 된 것 같기는 한데..
그런데 100ug이나 loading 했는데 폰슈 염색 시에 밴드가 보이지 않은 것도
걱정은 됩니다. 저라면 아마 이 단계에서 뭔가 이상한 걸 느끼고 다시 진행했을 것 같아요.
그리고 2, 3의 문제일 가능성은 매우 낮다고 생각합니다.
- 100ug/lane이라고 했는데 뭔가 착오가 있는 것 같은데 한번 확인해 보세요.
- -80도 lysate는 sample buffer를 추가한 상태에서 냉동했나요?
- lysate를 sample buffer없이 -80도 냉동한 상태라면
-80도 lysate -> 해동 -> <u><strong>mix well</strong></u> -> sample buffer 추가 -> heating의
순서대로 시료를 준비 했나요?
- APS가 문제가 있으면 gel이 굳지 않습니다.
- 실험에서 시약이 문제가 있는 것은 현상을 보고 판단하면 됩니다.
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레벨3
아스널
(대학원생)
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22.07.14 14:40
<strong>1. anti-mouse 그리고 anti-rabbit인 것 확인했고 HRP conjugated 된 2차항체를 사용했습니다. 2차항체는 새로 구매한 제품입니다.</strong>
<strong>2. 100ug/lane이라고 했는데 뭔가 착오가 있는 것 같은데 한번 확인해 보세요.</strong>
-> cell lysate 1 uL + PBS 9 uL + working solution 200 uL 넣고 OD 측정
cell OD1 = 0.5, cell OD2 = 0.4
blank OD1= 0.1, blank OD2 = 0.1
average cell OD - average blank OD = 0.45-0.1 = 0.35
회귀선형식을 이용하여 구한 샘플 1 uL당 단백질 농도 = 30 ug/mL
1) 100 ug 단백질 따려면 몇 uL 필요한가? = 100/30 = 3.3 uL
2) PBS 필요 용량 = 40-3.3 = 36.7 uL
3) 5X sample buffer 필요 용량 = 10 uL
따라서, 1) ~ 3) 더하면 총 50 uL이 되고 25 uL을 lane에 넣어 running
blank을 안 빼주고 회귀직선식을 구하는 경우도 있는데 저는 blank가
단백질이 아니기 때문에 샘플 OD값에서 blank OD값을 뺐습니다.
<strong>3. -80도 lysate는 sample buffer를 추가한 상태에서 냉동했나요?</strong>
-> 아닙니다.
<strong>4. lysate를 sample buffer없이 -80도 냉동한 상태라면 </strong>
<strong>-80도 lysate -> 해동 -> <u>mix well</u> -> sample buffer 추가 -> heating의</strong>
<strong>순서대로 시료를 준비 했나요?</strong>
-> 네, 맞습니다. 5X sample buffer 40 uL와 cell lysate 160 uL 넣었습니다. 그리고 heating 후에 -20도에 보관했습니다.
<strong>5. APS가 문제가 있으면 gel이 굳지 않습니다.</strong>
-> 아, 그렇군요. 감사합니다!
<strong>6. 실험에서 시약이 문제가 있는 것은 현상을 보고 판단하면 됩니다.</strong>
-> 이건 제가 실험을 많이 해봐야 알겠네요. 연습만이 길이군요. 감사합니다!
- 단백질 농도가 30ug/mL이면 100ug loading을 할 수 없습니다.
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레벨3
아스널
(대학원생)
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22.07.14 15:19
그러면...애초에 BCA assay 계산 자체를 잘못한 것이었군요. 감사합니다....ㅠㅠ
농도가 30 ug/ml 이라면 100 ug에 필요한 양은 3.3 ml이 되지 않을까요?