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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 HisPur Ni-NTA Purification시 Elution result check 시 multi band
올챙이agaz(대학생)  | 07.11 13:44

upload_image      

1:Ladder 2:supernatant of cell lysate before induced 3: supernatant of cell lysate after induced  4~6: purified protein Elution  7: 알고있는 protein 8:Ladder

안녕하세요, 현재 저는 pet28a(+)를 backbone으로 recombinant protein을 발현 중에 있습니다. 4~6번까지 sample은 300mM imidazole condition으로 His tag정제를 한 결과물입니다. 여쭤보고 싶은 것은 제가 예상한 protein의 분자량이 약 60kDa에서 보여야 하는데 4번 lane에서 여러 밴드가 뜨는 것을 확인하였습니다.   imidazole의 concentration이 적은 것은 아닌 것 같은데 여러 밴드가 뜨는 이유가 궁금합니다. 또한, 기본 pet 28a(+)에서 thrombin cut을 하지 않고 His-tag purification만 해도 되는 지도 궁금합니다.

감사합니다. 

#6xHis
 
#Thrombin site
 
#protein purification
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  07.11 14:18  

- 유도 전, 후 lysate를 보면 유도가 안된 것 같습니다.

올챙이agaz  |  07.11 14:56  

감사합니다. Re-induction하는 중입니다. 혹시 그렇다면  Elution 후 multi-band가 뜨는 경우도 있을까요?

대왕개구리SPEED  |  07.11 15:01  

- his 정제를 해도 multi band가 나오는 것이 일반적입니다.

 

- 깨끗하게 나오는 경우도 있지만 1band를 기대하는 것은 무리가 있습니다.

대왕개구리강시  |  07.11 15:09  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

몇가지 수정했으면 싶은 것이 보이네요.

IPTG induction이 잘 안된것 같아요. 전혀 안된것은 아니지만 너무 적게 induction 된것으로 보입니다.

induction시간과 IPTG 농도를 달리해서 최적의 조건을 잡는 것이 좋습니다.

 

정제를 하면 보통은 잡밴드 하두개는 늘 따라옵니다.

induction된 단백의 양이 엄청 많다면 정제후에 단백질을 젤에 걸었을때 잡밴드의 양이 상대적으로 적어서 안보이기도 합니다.

IPTG induction 된 것도 적고 정제된 단백질 양이 적다면 thrombin cut을 해서 Ni-NTA 컬럼을 통과시키세요. 어차피 재조합 단백질에서 레진에 붙는 부분이 HIS-tag이고, 잡단백질도 레진에 붙는 것이니, thrombin으로 cut 한 다음 컬럼을 통과사키면 HIS-tag 조각과 잡단백질은 레진에 붙고 재조합 단백질만 통과합니다.

올챙이agaz  |  07.12 12:37  

귀중한 답변 감사합니다. 마지막으로 여쭤보고싶은 것이 있습니다.

Snap gene application에서 Thrombin site뒤 in frame of thrombin site라 나오는데, Thrombin cut을 할 시 Amino acid가 shifting 될 가능성이 없을 지와, 

실례지만 Thrombin cut kit는 represent하게 sigma사나 abcam사를 이용하는 지 여쭤봐도 될까요?? 

감사합니다. 

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