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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 HEK293 Membrane protein purification (his tag)
뒷다리냥뮹(대학원생)  | 07.07 19:14

안녕하세요, 현재 HEK 293에 C-term his tagtransmembrane protein을 transfection 시킨 후 단백질 정제를 시도하는 중에 막혀 질문 남깁니다. 

 

문제는 비드에 타겟단백질보다 다른 non-specific 단백질이 더 강하게 바인딩한다는 것입니다. (cell lysate에서는 발현 확인)

 

먼저 protocol에 대해 간략하게 설명드리자면

buffer
- 50 mM sodium phosphate buffer (pH8.0)
- 150 mM NaCl
- 0.005% Tween 20
- 1 mM TCEP
- 20 mM Imidazole (binding/washing)
- 50~200 mM Imidazole (elution)
- protease inhibitor

* Tween 20은 0.05, 0.1%까지 사용해보았으며 tris buffer pH7, pH8 모두 사용해보았고, NaCl도 300 mm 까지 사용해보았으며 200 mM 이후 bead에서도 non-specific band만 있고 target은 없는 것을 확인하였습니다.

1. Cell을 scraper로 뗀 후 centrifuge (4000~10000g 3 min)
2. Binding buffer로 pellet을 풀어준 후 sonication 1분 진행 (1sec on/ 1sec off)
3. 평형시켜놓은 Ni-NTA bead 와 1시간 binding (4도)
4. washing 및 elution



이것저것 조사중에 membrane protein extraction 과정이 있던데, 대부분 bacteria에서 진행하거나 이를 통해 WB를 확인하는 용도더라구요. 대부분 centri를 통해 membrane fraction pellet을 얻던데, extraction 후 똑같이 풀어주어서 his tag purification 을 진행해도 되나요? 아니면 다른 방법이 있을까요..? mammalian cell 에 대해서는 잘 안나와있어서 혹시 참고할 만한 문헌을 알려주시면 감사하겠습니다ㅠ ㅠ

#membrane protein purification
 
#mammalian cell
 
#His tag protein purification
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  07.08 08:47  

- membrane protein을 회수하는 것과 정제는 별개의 문제로 각각 생각해

봐야 합니다.

 

- 현재 sample에 100% target protein(+His tag)이 있는 것은 어떻게

확인했나요?

 

 

222  |  07.08 09:19   

bead binding 정제를 위해서는 단백질이 soluble 상태여야 합니다.

cell lysis 후 membrane protein은 대개 insoluble하므로 supernatant에 target protein이 없어서 bead에 다른 non-specific protein들만 확인이 되는겁니다.

뒷다리냥뮹  |  07.08 09:33  

현재 sample에 100% target protein(+His tag)이 있는 것은 어떻게

확인했나요?

- RIPA buffer로 lysis 후 transfection 하지 않은 cell과 비교하였을 때 his tag antibody로 잡았을 때 non-specific band가 강하긴 했지만 target protein antibody로 잡았을 때 동일한 위치에서 밴드를 확인하였습니다.

- 하지만, 정제 후에는 non-target band만 뚜렷히 남고 아무것도 없습니다..
 

lysis 후 membrane protein은 대개 insoluble하므로 supernatant에 target protein이 없어서 bead에 다른 non-specific protein들만 확인이 되는겁니다.

- sonication과 detergent외에도 membrane protein을 solublization 시키는 걸로 부족할까요 ㅠ? 답은 denaturation - re folding 인가요..?

대왕개구리SPEED  |  07.08 09:45  

- target protein의 lysate를 원심분리하여 sup.만 Ab로 detection했나요?

뒷다리냥뮹  |  07.08 09:53  

넵 그렇습니다, 혹시 몰라 다음주에  whole lysate도 확인 예정입니다 ㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  07.08 10:01  

- sup.을 확인했다면 적어도 insoluble은 아닐것 같습니다.

 

- 시료를 imidazole 0mM, NaCl 300mM로 만들어 resin에 붙여 보세요.

 

- 현재 조건에서 target이 아예 안붙나요?

뒷다리냥뮹  |  07.08 10:31  

넵 거의 안붙습니다, 붙어도 WB 상에서 non-speific band가 너무 강하게 발현하고 있어서 정제의 의미가 없더라구요..

Imidazole을 없앴을 때도, NaCl을 300까지 올렸을 떄도 변화가 없었습니다 ㅠㅠ mammalian cell에 his rich 가 많아서 non-specific band가 많이 붙는다고는 들었는데, membrane protein이라 lysis 후 양이 적다보니 더 많이 붙는 것 같습니다 ㅠㅠ.. 참고로 이 non-specific band는 50,100,200 mM에서 다 elution 되는데 50 mM에서 더 많이 떨어지는 거 봐서.. 아예 binding이나 washing 을 50 으로 진행해볼까 생각중입니다..

대왕개구리SPEED  |  07.08 10:48  

- 현재 상태라면 IEX를 먼저 하는 것이 좋을 듯 합니다.

 

- imidazole을 50mM로 올리면 실험이 더 안되겠죠.

 

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