실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
colony PCR 후 sequencing multiple peak 문제..ㅠㅠ
레벨1 레오뀨 (대학원생)
안녕하세요
특정 유전자를 vector에 옮기는 TA cloning 작업을 하고 sequence가 정상적으로 들어간 것을 확인했습니다.
그리고 이 유전자에 삽입해주었던 enzyme으로 cutting하고 넣어주고자 하는 vector에 ligation하여
colony PCR로 insert 사이즈가 정상적으로 잘 뜨는것을 확인까지 했는데..
문제는 다 정상적으로 잘 되는것을 확인했음에도 불구하고, 최종 sequence를 보내면 peak가 깔끔하게 뜨지 않고 multiple로 지저분하게 뜨면서 제대로 읽히지 않습니다ㅠㅠ
vector랑 ligation한 후에 colony가 너무 자잘하게 많이떠서 이부분이 문젠가 하여
ligation 조건을 16도씨 O/N도 해보고 벡터 인서트 양도 줄여보고 com cell양까지 다 줄여봤는데도 multiple peak가 해결되지가 않습니다ㅠㅠ
동시에 진행한 다른 유전자는 지금 정상적으로 완성되어서 vector contamination은 아닌것 같습니다. 여러 gene을 cloning 중인데 뚜렷한 이유없이 이 유전자만 잘 되지 않습니다..
insert는 3.8kb, vector는 4.7kb입니다
enzyme site는 hind3와 xho1을 사용했는데, enzyme site문제일 수 있을까요..?
enzyme site를 바꿔서 다시 primer를 제작하거나 다른 vector로 사용하면 문제가 해결이 될까요 ㅠㅠ?
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