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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 웨스턴 고수님들 도와주세요ㅜㅜ
올챙이열두시삼십분(대학원생)  | 06.27 17:15

너무 답답해서 여기다가 올립니다.

보통 웨스턴 진행을 하고 transfer를 하잖아요?! 근데 transfer 후 membrane에 marker가 윗 부분만 남고 아래는 다 사라졌어요,, gel에도 marker가 안 남아있었어요,, 그럼 다 membrane에 옮겨가는 게 원래 맞는 거 아닌가요?! 왜 사라졌을까요 ㅠㅠ 아주 희미하게 옮겨갔는데 제가 못 보는 걸까요? 혹시  저같은 경험 가지신 분 계신가용? 실험 초짜라 이래저래 실수도 많이 해서 넘 답답하네요,,,

이렇게 될 경우 protein도 detection이 되지 않을 가능성이 높나요?!

 

지금까지 해오던 과정이랑 똑같이 했는데 이번엔 왜 저러는지 알수가 없네요 ㅠㅠ transfer 시간도 길게 잡아주고 sandwich도 잘 만들어서 했는데,,,,

#transfer
 
#western blot
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리지나가는 생물학자  |  06.27 17:18  

젤은 몇프로인지.. 트랜스퍼 조건은 어떠한지.. 알려주셔야.... 알려드릴수 있지 않을까요??

올챙이열두시삼십분  |  06.27 17:20  

젤은 10%로 만들어서 진행 했고, 트랜스퍼는 100V에 2시간 진행 하였습니다. 이전에도 똑같은 조건에서 진행을 했는데 그 때는 marker가 잘 나왔는데 이번엔 마커가 사라졌네요ㅜㅜ,,, 딱 맨 위에 250kDa 짜리 하나만 나왔습니다,,

개구리지나가는 생물학자  |  06.27 17:25  

100V에 2시간인데 그전에는 잘 나왔나요?? 열이 나지는 않았나요??

보통 10프로 젤은 70~90V 한시간이 적당합니다..(물론 실험실에서 쓰는 기기마다 다르긴 합니다만... 저정도는 아니에요)

2시간을 넘기는 트랜스퍼는 150이상 사이즈를 다 넘겨주기 위함일 경우가 많아요...

아래 사이즈는 다 나갔을 가능성이 있어요..

마커를 로딩하고 트랜스퍼를 시간별로 확인해 보세요.. 1시간, 1시간 반, 2시간 이렇게 확인해 보시면 더욱 정확하게 아실수 있어요.. 

젤 한장에 마커만 한 3개 걸고 잘라서 각각 트랜스퍼 해보세요.. 

실험은 뭐든 잘 경험하고 그 경험으로 배우는거니.. 많이 해보시고 습득하세요.

올챙이열두시삼십분  |  06.27 17:33  

넹,, 그 전에 똑같은 조건 (100V, 2시간)에서는 잘 나왔습니다..!! 제가 사이즈가 큰 protein을 관찰해야 해서 시간은 저 정도 넉넉히 잡았구요 ㅠㅠ

 

발열 문제 역시 아이스팩 넣고 밖에도 얼음으로 둘러줬습니다. ㅜㅜ 

그럼 marker가 membrane에 잘 안 넘어왔다고 하면, protein 역시 detection 되지 않을 확률이 높을까요?! 

또 gel에 마커가 정말 하나도 안 남겨져 있는데 membrane을 뚫고 흘러간 걸까요?ㅜㅜ

 

이런 경험은 처음이라 너무 당황스럽네요. ㅜㅜ

대왕개구리SPEED  |  06.27 18:02  

- 만약 시간이 길었다면 저분자는 membrane 반대로 넘어갑니다.

 

- target 분자량이 얼마인지 모르겠지만 90분 정도면 충분하지 않을까

보입니다.

 

- 현재 상태에서 고분자는 잘 나올것 같은데 internal STD가 나올지는

실험해봐야 알수 있을 것 같습니다.

 

- membrane을 폰슈 염색을 한번 해보세요.

올챙이열두시삼십분  |  06.27 18:31  
감사합니다. ㅜㅜ
경험상  |  06.29 22:58   

가끔 실수로 +- 반대로 꼽거나 젤 메브레인 반대로 위치 시킨면 열때문에 마커가 조금 넘어 간것 처럼 보일때도 있습니다. 저도 10년넘게 웨스턴했지만 가끔 아주 가끔 한번씩 뭐에 홀린것처럼 이런 실수를 합니다. 또 가끔 회사마다 +-색깔이 반대인 기계들도 있으니 잘 확인해 보세요

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