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질문 pcr 관련 질문드립니다
알ssonsson(대학원생)  | 06.24 20:46

4.5kb band pcr을 진행중인데 band가 전혀 뜨지 않습니다.

pcr 조건은

pre-denaturation 95도 2분

denaturation 95도 30초

annealing 은 primer tm 보다 10도정도 낮게 30초 

retention time 5분

총 30cycle진행했습니다.

pcr을 총 8번 정도 진행하면서, annealing tm, taq pol, dNTP, buffer도 바꿔가면서 진행했고, genomic DNA도 새로 뽑아서 진행해봤습니다.

어디서 가장 큰 문제가 있었을까요?

그리고 추가적으로 primer 농도가 높게 들어가면 결과가 잘 안나올 수 있나요? 

#pcr
 
#dna
 
#primer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  06.24 22:41  
원핵세포 gDNA를 증폭하나요?

Primer 길이와 annealing temp.는 어떻게되나요?
개구리닥눈삼  |  06.24 23:22  

4.5 kb면 PCR 반응시간부터 늘려야할 것 같습니다. 어떤 taq 사용하시는지 모르겠지만 데이터시트 확인하셔서 extension 시간 늘리시고, annealing temp.는 gradient로 쭉 걸어보세요.

알ssonsson  |  06.25 03:05  
진핵세포이고 primer 길이는 40bp, annealing tm은 55도 입니다.
알ssonsson  |  06.25 03:07  
그리고 pcr하실때 커버온도 끄고하시나요 키고하시나요??
대왕개구리SPEED  |  06.25 08:59  

- lid는 heating해야 합니다

 

- 55도에서 비특이 band라도 나와야 할건데 아무 band도 안나온다는 것이

조금 이상합니다.

 

- 4.5Kb가 exon + intron 크기인가요?

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