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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 KO 마우스 판별을 위한 PCR primer 관련하여 질문 드립니다.
알dingdongdang(대학원생)  | 06.24 15:42

안녕하세요, 

브릭에 계신 연구자님들께 조언을 듣고 싶어서 질문을 올립니다. 

 

다름이 아니고 저희가 헤테로 마우스끼리 교배해서 낙아웃 마우스 제작 중에 있는데, 확률 상 1/4인데도 낙아웃 마우스가 너무 나오지 않아서 문의 드립니다. 

현재 저희 연구실에서는 헤테로 마우스끼리 교배한 새끼들을 toe cutting 하여 genomic PCR로 유전자형을 분석하고 있습니다. 

저희가 쓰는 primer가 WT reverse, WT forward, KO reverse, KO forward 총 4개이고, 이 4개의 primer를 사용하여 PCR을 하면 KO band만 관찰 되는데, 더블 체크를 위해서 동일한 샘플에 WT primer만 사용하여 PCR을 다시 하면 예상대로는 아무 band도 관찰이 안 되어야 하는데 (된다고 해도 100 kda 이하의 nonspecific band) WT band가 선명하게 관찰 되어서 이러한 현상을 문의 드리고자 합니다. 

 

교배 상에서 헤테로만 나오는 것인지, 아니면 PCR 시 어떠한 문제가 있어서 KO 마우스 판독이 불가능한 것인지 문제점을 모르겠어서 혹시 이런 부분에 조언 주실 것 있으면 마음껏 해주시면 감사드리겠습니다.... ㅠㅠ 

 

#PCR
 
#녹아웃마우스
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리영빙구  |  06.24 16:10  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

정확히는 알수 없으나 4개의 primer를 이용하는 시스템이 문제가 있는듯합니다

[Genotyping PCR 관련]
일단 genotyping 하실때 WT set, KO set를 따로 진행하는 걸 추천드리구요 한번에 하실려면 WT primer를 다시 디자인하셔야 될듯해요

WT은 잘 나온다고 하셨으니 KO set도 진행해서 band다시 확인해보시구요!

지금은 마우스가 WT인지 Hetero인지 KO인지 판별하는게 먼저인듯합니다

판별한 뒤에 4개 primer 시스템으로 시도해보시구요

[마우스 관련]
Hetero끼리 교배했을때 KO이 안나올수도 있습니다 하시는 target이 무엇인지는 모르겠지만 KO이 lethal 그니까 죽는 phenotype일수도 있어요
(저같은 경우에는 100마리 정도 genotyping했는데 KO이 안나오고 수정란?태아일때 DNA뽑아서 해보니까 KO 확인할 수 있었어요)

이미 알려진 거라면 mouse 자체의 문제일수도 있습니다
(마이너하지만 초산이라던가, 스트레스때문에 새끼를 잡아먹는 다거나 등등이요)

 

결론만 요약하자면 일단 KO set로 band 나오는지 확인해보시고 나온다면 지금 있는 DNA들로 type부터 판별한 뒤에 생각하셔야 될듯합니다

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