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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 linker sequence는 어떻게 삽입하나요?
학부생  | 2009.03.14 00:22
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
안녕하세요 저는 vector construction 중인 학부생입니다

제가 디자인한 vector는 이런 모습이에요

MCS - linker - reporter gene

그리고 pET series를 parent vector로 해서

reporter gene과 linker를 집어넣을려고 하는데요

reporter gene같은 경우엔 그냥 기본적인 cloning을 통해 삽입하면 될것 같은데

linker는 어떻게 만들고 집어넣나요?

한 8~12 aa의 peptide를 linker로 사용하려고 합니다

읽어주셔서 감사합니다

좋은 하루 되세요
#linker
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리TX  |  2009.03.14   
간단하게 linker에 해당하는 oligomer를 합성해서 ligation 하시면 됩니다.
양 끝은 restriction site (잘린 상태..)에 맞게 합성하시고요..
5'' phosphorylation해야 하구요..

또 다른 방법은 PCR할때 extra sequence로 linker를 넣고 해도 됩니다.
대왕개구리엘피스  |  2009.03.15   
Linker의 sequence를 포함하는 primer를 디자인하여 vector를 통채로 PCR해보세요.

저도 개인적으로 많은 vector들을 만들고 modify하고 있는데, 항상 이와같은 방법을 사용합니다.
학부생  |  2009.03.15    
TX님, 엘피스님 귀중한 조언 감사합니다

그런데 엘피스님께서 답변해주신 내용 중에 질문이 있어요

만일 vector sequence가 YYY YYY ↓ YYY YYY 이런 식이고

↓ 부분에 XXX XXX ... XXX XXX 의 linker sequence를 삽입하고자 한다면

YYY YYY XXX XXX ... XXX XXX YYY YYY 이런식으로 primer를 짜서 PCR하면 되는건가요?

아직 DNA manipulation에 서툴러서 모르는 점이 많네요

감사합니다
대왕개구리엘피스  |  2009.03.15   
첨부파일 파일첨부: vector PCR.ppt (26 KB)
제가 요즘하고 있는 내용을 일부 정리해 놓은 것입니다.
참조해보시고....

Vector의 크기는 3kbp정도 되기 때문에 annealing 58C 30초 extension 72C 2분 정도 주어 template 10-100pg을 사용해 30cycle정도 PCR을 하면 충분한 양의 DNA를 얻을 수 있습니다.

primer에 붙이는 임의서열의 크기를 100bp까지도 해본적이 있으며, 이 역시 working을 잘합니다 (물론 primer합성이 오류가 없다는 전제하에서).

그럼 좋은 결과얻으세요.
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