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일단 실험과정중에 큰 문제가 있어보이지는 않는데
제가 생각하는 가능성 있는 문제점들을 말씀드리면
1. Fixation 혹은 washing과정 중 cell loss.
2. DAPI solution 농도가 너무 낮을 경우
3. DAPI staining이후 washing하지 않아 backgroound 뭍혀 안보일경우
정도 일거 같은데..
형광 찍으실때 exposure를 낮춰서 봐도 안보이는 거라면 1번 2번이 유력해 보이네요
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레벨2
eunseuli
(대학생)
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22.06.23 15:37
혹시 subculture를 어제 했는데 아직 cell이 많이 증식을 하지 않았더라도 잘 stain이 안 될까요..??
현미경으로 봤을때 셀이 한개라도 정상적으로 붙어있었다면 보여야 하는게 정상인데, 염색 후에 현미경으로봐도 셀은 보이는 상황 이셨다면, DAPI가 정상적으로 염색이 안된것으로 봐야 활것 같으니 DAPI 농도를 확인 해보심이...
근데 DAPI를 방울 이라고 표현하신게, mounting solution에 DAPI들어 있는것을 사용 하셨다는 얘기 일까요? 그렇다면 더더욱 염색 안되기가 어려운데..
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레벨2
eunseuli
(대학생)
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22.06.23 16:06
네 맞습니다.
Subculture한지 얼마 안 되긴 했지만 현미경으로 봤을 때 붙어 있던 상태였어요.
Protocol도 맞다고 하시니 문제가 뭔지를 모르겠습니다ㅠㅠㅠ
혹시 그럼 사진 찍어 두신게 있으실까요? 아님 같은 프로토콜로 이전에 확인 하셨던 데이터는 있으신지..?
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레벨2
eunseuli
(대학생)
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22.06.23 16:27
어둡게 했을 때 전혀 안 나와서 따로 찍어두진 않았습니다.
이번에 처음 해 본 거라 이전 데이터나 사진도 없어요...
당연히 형광 필터는 잘 맞추고 보신걸테고...
딱히 문제될 부분은 없는거 같은데
다시 한번 해보는 수 밖에 없을거 같네요...
다피는 진짜 대충해도 잘 나오는거라서... 차근차근 재실험 해보시는게 나을거 같아요.
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레벨2
eunseuli
(대학생)
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22.06.23 16:38
답변 감사합니다!!
fix/perm을 같이 하는 kit가 아니라면
Permeabilization Reagent를 사용하면 DAPI가 훨씬 잘 들어갑니다.
보통 300-500nM 농도로도 잘 염색이 되는데요
혹시 DAPI filter가 현미경이 있는 것은 확인 하셨나요?