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 전체 > Cell Biology > Cell Cycle
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질문 Cell cycle analysis 질문드립니다... 살려주세요 ㅠㅠㅠ
알쥬쓰(대학원생)  | 06.22 17:54

안녕하세요 현재 ROS activity, Apoptosis rate에서 Apoptotic cell 증가 확인 후 Cell cycle analysis 진행중인 대학원생입니다...

 

논문에서 나온 프로토콜로 진행중인데 도저히 G0/G1 phase, S phase, G2/M phase 층 생기는게 관찰되지 않습니다.

upload_image

이렇게 찍혀버리는데 왜 층이 안생기는지 모르겠어요...

 

프로토콜은 다음과 같습니다.

1. 6well plate에 well당 10만 seeding

2. chemical 처리 후 24hr treatment.

3. Media, DPBS washing buffer, Trypsin-EDTA 후 Media 추가한 용액까지 전부 모음.

4. 상층액 제거 후 DPBS resuspension, 300g로 5분 centrifugation 후 상층액 suction.

5. 상층액 suction 후 각 PBS 500ul로 resuspension

6. chilled 70% ethanol in DW로 4.5ml 약하게 vortexing 하면서 첨가

7. 4도 냉장고에 30분 이상 incubation (or more)

8. incubation 후 300g로 5분 centrifugation.

9. 상층액 suction 후 PBS 5ml로 resuspension

10. 300g로 5분 centrifugation.

11. 상층액 제거 후 PI staining solution (0.1% Triton X-100, 100ug/ml RNaseA, 15ug/ml PI in PBS) 각 Sample당 1ml로 resuspension후 37도에서 10분 암조건으로 incubation

12. FACS 측정.

 

여기서 혹시 제가 어떤 문제가 있을까요...? 프로토콜 논문을 2개를 찾아보면서 이것저것 1달을 해봤는데 도저히 층이 생기지 않아서 여쭤봅니다..... 살려주세요.... cell cycle했던 사람들이 다 졸업하거나 사라져서 물어볼 사람이 없어요,,,

#Cell cycle analysis
 
#FACS
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리지나가는 생물학자  |  06.23 09:22  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

게이트를 저렇게 하는게 확실한가요?

기기 마다 찍는 방법이 다르겠지만..

https://www.abcam.com/protocols/flow-cytometric-analysis-of-cell-cycle-with-propidium-iodide-dna-staining

참고 하시구요..

보통 FL2A, FL2W로 마지막 포션을 잡고 200과 400 지점에서 피크를 위치하여 분석합니다..

 

전체 게이팅하여 메인 파트만 잡아서 FL2 로 다시 잡아 보세요

알쥬쓰  |  06.24 22:55  
아 감사합니다!! doublet 최대한 제외하니까 층은 안생겨도 페이즈별 구분이 가능해졌어요!!
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