실험 Q&A Cell Biology > Cell Cycle
PI staining, FACS로 apoptosis 확인하는 실험
레벨1 팩스지옥 (대학생)
안녕하세요 FACS BD calibur를 이용하여 drug 처리한 샘플의 apoptosis 를 확인하는 실험을 하고 있습니다.
Annexin V 는 사용하지 않고 일단 PI staining 만 하여 sub-G1 증가를 확인하려고 하는데요.
drug 처리 하였을 때 cell proliferation 은 감소하는데 control, treat에서 sub-G1 및 다른 cell cycle 마저도 변화가 없어서 답답하여 질문 드리게 되었습니다. 첨부 된 피피티에서 위가 control, 아래가 treat 입니다.
일단 제가 하고 있는 프로토콜은요
1. cancer cell에 드럭 처리하여 24, 48시간 후 cell harvest (미디어 까지 다 따줍니다)
2. 150*10^4 의 셀을 모아 센트리 돌려서 미디어 석션, PBS wash 두번
3. 70% ethanol fixation, FACS 찍기 전까지 -20도 보관
4. FACS 찍는 날 샘플 센트리 돌려서 ethanol 석션, cold PBS wash 두번, cold PBS 에 cell suspension
5. RNase 5ul 넣고 30 분 상온에서 incubation, 10분마다 약하게 볼텍싱
6. PI 12.5ul 넣고 약하게 볼텍싱 후 10분 ice 에서 incubation 후 FACS 찍기
입니다.
혹시 왜 죽은 셀들이 FACS만 찍으면 안보이고 sub-G1에 변화가 없는지 아시는 고수님 계실까요ㅠㅠ
감사합니다.
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