semi dry transfer로 할때는 membrane을 한번에 1개-최대 2개까지만 가능합니다
저도 4개까지 해봤는데 밴드가 물결무늬로 나타나고 새는것처럼 보이더라구요
그리고 semi dry transfer더라도 140kDa 정도의 큰사이즈 프로테인은 1시간까지 transfer시간을 늘려보시는게 좋을것같습니다.
그리고 membrane뒤로 3M PAPER로도 transfer가 되는거는 좀 이상하긴한데...
protein사이즈가 작은걸 transfer할때는 membrane 2장겹쳐서 transfer한다고도 하더라고요.. 선생님꺼는 사이즈가 크긴하지만 이런문제 발생하니까, 멤브레인 2장겹쳐서 transfer해보는게 어떨까요?
-
레벨5
지나가는 생물학자
-
22.06.10 13:47
트랜스퍼 버퍼 조성을 바꿔보세요.
Transfer Buffer: for 1L 5.8 g Tris Base 2.9 g glycine 0.37 g SDS
---Make to 800 mL with dH2O, then add 200 mL MeOH---
SDS가 들어가면 찌글찌글해지는 현상이 없어질겁니다.
그리고 세미 트랜스퍼는 그냥 트랜스퍼보다 시간이 훨씬 짧게 해주셔야 합니다.. 3M paper에 ladder가 넘어갔어도 단백질은 멤브레인에 있을수 있으니 확인해보세요 (액틴으로 먼저 테스트 하면 좋겠지요..)
-
레벨2
rlaeheod
(대학원생)
-
22.06.10 13:48
뭉치쭈꾸님 감사합니다!
다음에 진행할 때는 맴브레인 두개를 겹쳐서 진행해보도록 하겠습니다~
확실히 기기 중앙 부분은 잘 넘어가는데 다른부분은 잘 안되는것같아요. ㅜ
-
레벨2
rlaeheod
(대학원생)
-
22.06.10 13:50
지나가는 생물학자님 감사합니다!
사실 저희가 transfer buffer를 10X로 만들어진 걸 희석해서 사용중입니다.
SDS는 포함되어있지않구요.
transfer buffer에 sds를 포함시키는게 일종의 해결방안이 될 수 있다니,,,
저는 sds로 인해 더 문제가 생길까봐 젤을 d.w로 한번 워싱하고, transfer buffer로 적셨거든요. 그 과정에서 오히려 더 우글우글한 밴드가 나타났을수도 있겠네요. 정말 감사합니다.
transfer buffer조성을 바꿔보도록 하겠습니다~!
semi-wet transfer 기계를 무엇을 쓰는지는 모르겠으나
제가 가지고 있는 기계로는 20V 15min 정도면 충분합니다.
기계 매뉴얼 한 번 확인해보세요.
-
kty1273@naver.com
(비회원)
-
22.06.13 13:19
정상적인 상황에 3m paper 로 ladder 가 넘어가기도 합니다.
다만, 너무 많이 넘어간다고 생각된다면 (membrane을 cbb 염색시 단백질이 거의 없는 경우) membrane pore size 가 너무 큰 것이 아닌지 고려해봐야 합니다.
pore size 가 0.45 um, 0.2 um 이 있을텐데 비싸도 0.2 um pore size의 membrane 사용을 추천드립니다.
140 kda 정도면 중간 사이즈 인것 같은데 제가 알기론 semidry mannual 에 protein kda 에 따라 설정 값들이 있는 것으로 알고 있는데 경험상 1hr 동안 진행한 경험이 없어 조금 긴것이 아닌지 생각됩니다.
정리하자면 pore size 파악, protein size 에 따른 설정값을 파악 한 후
실험을 진행해보길 바랍니다.