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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 담배로 co-IP를 하는데 이상한 것이 있어 문의합니다.
알서eee(대학원생)  | 06.09 10:47

담배에 아그로박테이리아를 이용해 co-IP를 진행할려고 합니다.

 

우선 protein이 제대로 웨스턴이 되는지 확인하기 위해서 예비 웨스턴을 해봤는데

 

저희가 사용하는 tag는 YFP와 FLAG입니다.

 

궁금한것은 3가지 조합으로 해봐는데 

YFP Ab에서는 1, 2번만 검출되고

반대로 FLAG Ab에서는 3번만 검출된다는 것입니다.

 

혹시 이런 경우 어떻게 해야 해결할 수 있을까요?

 

1. YFP

2. YFP + GENE-FLAG

3. GENE-YFP +GENE-FLAG

#co-IP
 
#western blot
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리지나가는 생물학자  |  06.09 11:02  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

담배는 해보지 않아서 잘 모르겠지만... 각각 하나씩 발현 시켜보셨나요? 하나씩 넣어서는 충분히 발현이 되는데 두개를 한꺼번에 넣었을때 발현이 잘 되지 않았다면, 충분히 담배에 들어가지 못했거나 발현을 할때 방해를 받았을수도 있어요.. 지금 저 실험 세트로는 확인이 어렵네요..

뒷다리PPlP  |  06.09 11:20  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 건강한 식물을 사용하였는가..? tobacco를 이용한 transient expression은 식물의 상태에 따라 좌우가 많이 됩니다. 보통 4~6주된 식물을 사용하며, 꽃이 피지 않은, 잎들이 넓게 넓게 잘 자란 식물을 사용합니다. 오래된 식물이나, 혹은 오래된 잎을 이용하여 발현시킬 경우, 발현자체를 잘 보기 힘듭니다. 또한 잎전체에 충분히 다 접종이 되야 합니다.

2. 접종 후, 몇시간 뒤에 prep하였는가? 보통 24~48시간 이내면 충분한 발현량을 얻을 수 있지만, 몇몇 protein들은 최장 72시간까지 지켜봐야 합니다. 이는 몇몇 protein들은 그 크기 혹은 cell내에서 타이트하게 quality control를 받기 때문에, 발현이 더뎌질 수 있습니다.

3. co-expression 시킬 경우, 각각 발현된 protein들이..서로 영향을 줄 수 있습니다. 직접적으로든 혹은 간접적으로든 transcription level에 영향을 주거나 혹은 protein turnover에 영향을 줄 수 있습니다. 예를들어, protein A , protein B를 같이 발현시켰는데.. 서로 동일한 Agro OD를 가지고 발현시켰다고 합시다. 그럴경우 때때로,, single 접종 때 보다 protein A 혹은 proteinB의 발현이 떨어질 수 있는 것입니다. 따라서 해당 문제는 접종후 prep 시점 변화 및 agro OD에 변화를 주어 확인해봐야 할 것입니다.

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