담배는 해보지 않아서 잘 모르겠지만... 각각 하나씩 발현 시켜보셨나요? 하나씩 넣어서는 충분히 발현이 되는데 두개를 한꺼번에 넣었을때 발현이 잘 되지 않았다면, 충분히 담배에 들어가지 못했거나 발현을 할때 방해를 받았을수도 있어요.. 지금 저 실험 세트로는 확인이 어렵네요..

1. 건강한 식물을 사용하였는가..? tobacco를 이용한 transient expression은 식물의 상태에 따라 좌우가 많이 됩니다. 보통 4~6주된 식물을 사용하며, 꽃이 피지 않은, 잎들이 넓게 넓게 잘 자란 식물을 사용합니다. 오래된 식물이나, 혹은 오래된 잎을 이용하여 발현시킬 경우, 발현자체를 잘 보기 힘듭니다. 또한 잎전체에 충분히 다 접종이 되야 합니다.

2. 접종 후, 몇시간 뒤에 prep하였는가? 보통 24~48시간 이내면 충분한 발현량을 얻을 수 있지만, 몇몇 protein들은 최장 72시간까지 지켜봐야 합니다. 이는 몇몇 protein들은 그 크기 혹은 cell내에서 타이트하게 quality control를 받기 때문에, 발현이 더뎌질 수 있습니다.

3. co-expression 시킬 경우, 각각 발현된 protein들이..서로 영향을 줄 수 있습니다. 직접적으로든 혹은 간접적으로든 transcription level에 영향을 주거나 혹은 protein turnover에 영향을 줄 수 있습니다. 예를들어, protein A , protein B를 같이 발현시켰는데.. 서로 동일한 Agro OD를 가지고 발현시켰다고 합시다. 그럴경우 때때로,, single 접종 때 보다 protein A 혹은 proteinB의 발현이 떨어질 수 있는 것입니다. 따라서 해당 문제는 접종후 prep 시점 변화 및 agro OD에 변화를 주어 확인해봐야 할 것입니다.