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질문 [western blot] Ponceau 염색 후 band 안 나오는 이유
앞다리experiment(대학원생)  | 06.08 20:15
첨부파일 파일첨부: membrane2.PNG (429 KB)
이미지 첨부파일

Western blot 과정 중 transfer 후에 ponceau 용액에 membrane을 담궈서 band 확인할 때 band가 안뜨는데 왜 그런지 아시는 분 있나요?

폰슈에서 안나오고, 마지막 detection까지 해도 band가 보이지 않습니다..transfer가 끝난 membrane을 보면 marker는 잘 묻어나는 걸 보면 transfer과정에서 큰 문제는 없었던것 같은데 왜 그럴까요?ㅜㅜㅜ

Protein 양=10ug 정도

PVDF membrane (Methanol로 적셔서 활성화 시킴)

transfer 조건= 100 V, 60 min

(-) Sponge-filter paper-gel-PVDF membrane-filter paper-sponge (+)

#westernblot
 
#ponceau
 
#transfer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
ㅇㅇ  |  06.08 22:00   

사진보면 마커가 젤에 남아있는거 아니예요...? 제가 잘못본건가요..?

앞다리experiment  |  06.08 22:08  
첨부파일 파일첨부: membrane.PNG (273 KB)
이미지 첨부파일

아뇨 membrane에 다 옮겨 졌어요!

ㅇㅇ  |  06.08 22:32   

어...지금 보면 초록색 윗 밴드 정도까지만 transfer 됐는데...제 경험으로 보면 12퍼센트 안팎의 젤에 내리신거같고 마커는 대충 30-40kda 어드메의 위치인거같거든요..? 물론 아닐 수도 있지만 제 눈엔 그래보여서 대충 말씀드려요...

근데 처 초록색 위의 파란색보다 더 위는 하나도 트랜스퍼가 안되서...트랜스퍼 자체가 잘 안된걸로 보여요 전...사이즈 얼마짜리를 디텍션하시는건가요? 

대왕개구리SPEED  |  06.08 22:39  
트랜스퍼에 문제가 있고 폰슈 염색사진 있나요?
앞다리experiment  |  06.09 04:39  

폰슈 염색 사진은 안 찍었지만 5분 넘게 염색해도 마커 제외한 어느 공간에서도 band는 안보였어요,,

저도 전기영동도 잘 진행된듯 하고 분명 transfer과정에서 문제가 있는것 같아서 모든 과정 재검토 중인데, 혹 transfer가 잘 되면 gel에 band는 육안으로 확인이 안되지만 maker도 완전히 다 membrane으로 넘어가나요??

개구리Q.E.D.  |  06.09 07:34  
첨부파일 파일첨부: 20200121_233433.jpg (1,513 KB)
이미지 첨부파일
Transfer step에서 문제가 있습니다.
현재 gel에서 큰 사이즈들은 하나도 넘어가지
않은 상태입니다.

전에 퐁슈를 찍어둔 사진이 있어 첨부합니다.
transfer후에 gel에 마커가 남아 있으면 않 됩니다.

참고로, 위 membrane은 PVDF 입니다.

대왕개구리SPEED  |  06.09 09:07  

- 폰슈에서 band가 안보이면 transfer가 안된 것으로 봐야 하며 이런 경우

gel을 염색해서 남은 band를 확인하는 것이 좋습니다.

앞다리experiment  |  06.09 22:14  

답변 감사합니다ㅜㅜ

 

ㅇㅇ  |  06.13 14:45   

제 경험상 PVDF는 폰슈 잘 안 되던데요....

NC는 잘 됩니다.

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