실험 Q&A Plant Biology > Transformation
식물세포를 액체질소 없이 -70℃에서 냉동보존할 수 있나요?
레벨2 이준승
저는 식물에 감염하는 세균(Pseudomonas syringae)을 연구하고 있습니다. 실험 과정 중에 식물 세포 배양(및 조직 배양)이 필요하게 되어 관련 자료를 찾아보던 중 궁금한 것이 있어서 질문 드립니다. 제가 궁금한 것은 식물 세포주를 장기간 보관하는 방법입니다. Arabidopsis, tomato, tobacco (담배) 세포주를 균주은행에서 분양받아 실험에 사용할 예정입니다. 식물 세포를 장기간 보존하는 방법을 찾아보니까 액체질소에 보관하는 방법이 있었습니다. 현재 실험실에 세균 냉동보관용 -75℃ deep freezer와 일반 가정용 냉동고가 있습니다. 질문 1. 액체질소탱크 없이 식물 세포 보관이 가능할까요? 만약 가능하다면 -75℃에서 어느 정도 보관이 가능한가요? 질문 2. 아래 프로토콜에 보면 1℃/분 속도로 -35℃ 또는 -40℃로 냉각하라고 되어 있는데 이것을 어떻게 하는건인가요? 질문 3. 액체질소 탱크에 주기적으로 액체질소를 보충해야 한다고 들었습니다. 그럴 경우 비용은 어느정도 예상해야 하나요? 어떠한 코멘트라도 감사히 듣겠습니다. ---- 인터넷에서 검색한 cryopreservation 방법 1. 세포 현탁 배양 - 비교적 높은 밀도의 세포를 6%(w/v) Mannitol이 있는 배지에 배양 - 4일 후 세포를 수확하여 부피의 30%까지 세포를 침전시킴 - 침전시킨 세포를 얼음위에서 냉각시킴 - 냉동보호제(cryoprotectant)용액을 조제하여 얼음위에서 냉각시킴 *냉동보호제: 1M DMSO+1M glycerol+2M sucrose(2배액 용액임) - 세포현탁액 1부피에 냉동보호제도 1부피를 천천히 가하여 섞는다 (냉동보호제는 상당히 끈적거림 즉, 점성이 있기 때문에 자력교반기로 섞는다). - 얼음 위에서 1시간 배양 - 2㎖ polypropylene ampoule 속에 냉동보호제를 섞은 세포현탁액을 1㎖씩 분주 - Ampoule을 1℃/분 속도로 -35℃까지 냉각 시킨 후 동일온도에서 40분간 유지함 - 액체질소 속이나 위에 저장함 - 해동은 40℃살균수 속에 ampoule을 집어넣는다(폭발조심) - 세포현탁액을 표준배지의 표면에 이식 - 표준조건하에서 2일간 배양 후 현탁액을 버린다 - 다시 표준 현탁액 배지를 첨가하여 배양함 2. 캘러스 보존 - 캘러스가 들어있는 배지를 얼음 위에서 냉각시킴 - 냉동보호제를 조제하고 얼음 위에서 냉각시킴 *냉동보호제: 20% DMSO+20% PEG+16% glucose(2배액) - 캘러스가 들어있는 배지에 동일 부피의 냉동보호제를 첨가한다 - 얼음 위에서 1시간 방치 - Ampoule속에 분주 - 1℃/분 속도로 -40℃까지 냉동시킨 후 액체질소에 저장 - 40℃의 살균수 속에 ampoule을 넣고 급속히 해동시킴 - 새로운 배지로 22℃로 세척 - 표준 반고체 배지에 치상
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