실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Transformation
plasmid reconstitution
레벨2 rlaeheod (대학원생)
안녕하세요.
제가 며칠전에 origene에서 plasmid를 구매해서 불리려고 하는데 트포가 안돼서 조언을 구하고 싶습니다.
plasmid는 lyophilized form이어서 NFW를 100ul 넣고(manual) 10분동안 기다렸다가 사용했어요.
1차 transformation : 50ul(HIT competent cell) + 2ul(plasmid)
selection marker : Kanamycin
근데 제가 centrifuge를 안돌리고 했더니 조금 문제가 생겼는지 콜로니가 안자라더라구요.
그래서 plasmid를 -20도에 보관하고 있던걸 꺼내서 다시 녹인 후 nanodrop으로 측정해보니 처음에는 농도가 4ng/ul 나와서 아차싶었습니다.
이때 근데 260/230 값이 40몇인가? 그래서 조금 문제가 되나 싶었습니다.
그래도 다시 녹여보면 되지않을까 싶어서 centrifuge 돌리고 상온에서 10분정도 기다려다가 다시 측정해보니까 500ng/ul까지 올라갔어요. 그리고 260/230 값도 2로 떨어졌구요.
그 상태로 다시 competent cell 100ul(10^8 cell) + 4ul(plasmid)넣고 트포를 진행했는데 오늘도 안나왔네요..
spreading할때는 LB 1ml 넣어서 50ul만 spreading했습니다.
트포는 nonheatshock competent cell로 진행했어요.
RBC에서 판매하고 있는 HIT competent cell입니다.ㅠㅠ
고수님들 도와주세요~
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