실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > Purification/Isolation
RNA 추출 관련 문의, lysozyme 및 TE buffer 제조 문의
레벨1 quirie-oh (과기인)
안녕하세요, 평소 궁금했던 점 찾아서 보곤 했는데 질문 올려봅니다.
실험의 개요는 그람음성세균에서 RNA 추출 후 mRNA를 cDNA 합성하여 RT-PCR하는 실험입니다.
현재 Qiagen RNAprotect bacteria reagent handbook을 보면서 그람음성세균의 RNA 추출실험을 준비하려고 하고, RNA 실험은 해보지 않은 초보자입니다.
1. 이 회사 제품은 RNA protect reagent를 처리하고 실험하라고 하는데, 이런 처리의 유무가 RNA 회수에 많은 영향을 미치나요? 다른 회사 제품에는 이런거 없는 kit도 있던데 궁금합니다.
2. cell lysis에 lysozyme, proteinase K incubation 하라고 되어 있는데,
이 회사는 Sigma L7651 lysozyme (>=40,000 units/mg)을 15mg/mL으로 포함한 TE(30mM Tris.Cl, 1mM EDTA, ph 8.0) buffer 200uL에 proteinase k를 10-20uL첨가하여 sample에 처리하라고 되어 있습니다.
1) 제가 lysozyme sigma L1667(>=100,000 units/mg) 을 가지고 있는데,
이것으로 40,000 unit 되게 계산해서 첨가해서 써도 될까요? 이 제품은 다른 회사 kit를 구매할 때 어느 회사 lysozyme을 쓰면 좋다는 정보가 없어서 제가 임의로 구입했던 것입니다.
2) 위의 내용에 맞게 희석해서 쓸 수 있도록 lysozyme은 stock으로 만들어놓고 -70도씨 보관하면서 꺼내써도 괜찮나요? 그냥 TE buffer에 녹여서 적정량 aliquot 해두고 쓰면 되는지 궁금합니다.
3. TE buffer 제조 관련 1M Tris,HCl(pH8.0)과 EDTA powder(EDTA.Na2.2H2O, F.W. 372.24)를 가지고 있는데, EDTA가 시약 통 라벨에 5% 녹였을 때 pH가 4.45라고 나와있습니다. (EDTA.Na2.2H2O, F.W. 372.24)는 인터넷에 보니 아래와 같이 나와있는데, pH를 보정해가면서 녹여서 8.0까지 맞춘 stock을 만들고 TE buffer 제조해야 되나요.
"Preparation Instructions: This product is slowly soluble in water at room temperature up to 0.26 M, which is approximately 96 mg in a final volume of 1 ml. The pH of this solution will be in the range of 4 to 6. EDTA salts are more soluble in water as the pH increases: the more EDTA there is in the salt form, the higher the pH of a water solution, and therefore, the higher the room temperature solubility. This can be achieved by a gradual addition of concentrated sodium hydroxide solution to the EDTA solution."
4. RNA 실험에 쓰이는 모든 도구는 0.1% DEPC 처리 등 해서 쓰라고 되어 있던데, lysozyme 정량할 때랑 EDTA 정량할 때 쓰는 시약 스푼 같은 것도 모두 EDPC 처리-열처리해서 DEPC 제거 이런 과정들 다 거쳐야 하는지요, 그리고 만약 EDTA를 pH 보정을 한다면 이 때 pH 전극 등 접촉으로 혹시 오염가능한 RNase는 어떻게 불활성화 할 수 있을까요?
5. 현재 타사의 RNA ectraction 추출 kit로 추출 후 gDNA가 잔류되어 qiagen으로 바꿔 해보려하는데 qiagen protocol에는 보통은 별도의 DNase처리가 필요없다고 하는데, 이 보통의 범위가 어느 정도인지 잘 모르겠습니다. 옵션으로 필요할 경우 RNeasy mini kit 사용시 RNase free DNase 처리를 washing 단계 전에 할 수 있다고 안내하는데, 그람음성세균의 RNA 추출시 DNase 처리 안해도 gDNA 잔류없이 잘 되었는지 어땠는지 아시는 분 있을까요?
자료를 찾아봐가며 준비하고 있기는 한데 하나부터 열까지 모르는 분야 실험이라 조언 부탁드립니다.
Bio마켓 프리미엄