너무 많이 나와서 saturation 이 됐을 수도 있을거같은데, 희석해서 assay 를 해봐도 좋을거같아요
-
레벨5
Coolzinc
-
22.05.30 09:32
샘플쪽 농도가 너무 높은 것 같은데요..
샘플은 희석해서 사용하신 후 결과값에 희석 배수를 반영하셔서 산출하시면 됩니다.
제 경험상 TNF-a는 1/50 희석을 주로 사용했었는데 한번 조건을 잡아보세요 ~
Raw cell의 경우 LPS를 처리하게되면 activation이 강하기때문에 높게나옵니다.
NO의 생성량과 TNF-a의 생성량은 다르죠.
50배, 100배, 500배, 1000배 까지 희석을 하여 test 해보세요.
Standard 중간값 정도가 적당한 희석 농도입니다.
-
레벨1
예비대학원생s
(대학생)
-
22.05.30 16:50
저희 방에 선배가 없어서 조언을 얻기 힘들었는데ㅠㅠ세 분 모두 답변 감사합니다 제가 희석은 아예 생각을 못했던 것 같습니다..!
그리고 답변을 받으니 궁금한게 생겼는데
1. RAW264.7 cell로 측정하는 TNF-alpha kit 외에도 대부분의 immunoassay kit를 사용할때 sample은 희석하고 사용하는 것이 일반적일까요?
2. 그리고 TNF-alpha kit에서, 예를 들어 50배 희석이 가장 적당했으면 다른 kit를 쓸 때도 50배 희석해서 한다고 생각하면 될까요?
희석해야하는 배수가 cell과 kit 마다 큰 차이가 있는건지, 추출물마다 큰 차이가 있는 건지 궁금합니다..
할때마다 몇 배 희석이 가장 적절한지 항상 찾아야하는걸까요..??
+ Sample은 추출물이며, 추가적으로 RBL-2H3 cell로는 TNF-alpha와 IL-4를, HaCaT cell로는 TARC 등을 측정해보아야합니다.
대충 아토피나 피부관련 질환 실험의 in vitro assay 중이시군요..ㅎㅎ
1. RAW264.7 cell로 측정하는 TNF-alpha kit 외에도 대부분의 immunoassay kit를 사용할때 sample은 희석하고 사용하는 것이 일반적일까요?
-> 아뇨 늘 그렇지는 않습니다. 저는 거의 희석 안하고 실험했어요. cell 마다 다릅니다.
2. 그리고 TNF-alpha kit에서, 예를 들어 50배 희석이 가장 적당했으면 다른 kit를 쓸 때도 50배 희석해서 한다고 생각하면 될까요?희석해야하는 배수가 cell과 kit 마다 큰 차이가 있는건지, 추출물마다 큰 차이가 있는 건지 궁금합니다..
할때마다 몇 배 희석이 가장 적절한지 항상 찾아야하는걸까요..??
+ Sample은 추출물이며, 추가적으로 RBL-2H3 cell로는 TNF-alpha와 IL-4를, HaCaT cell로는 TARC 등을 측정해보아야합니다.
-> 그 부분은 논문에서 확인해보셔야합니다. 가령 standard는 1000까지인데 논문에서 사용하는 값은 10000대라던가 아니ㅊ면 단위가 다르다던가...이런식으로해서 확인해보셔야합니다.
건투를 빕니다 :)
1. RAW264.7 cell로 측정하는 TNF-alpha kit 외에도 대부분의 immunoassay kit를 사용할때 sample은 희석하고 사용하는 것이 일반적일까요?
->처음 테스트시에는 무조건 희석배수를 진행해보셔야해요.
원액 무조건 포함해서 10배 50배 등등.
2. 그리고 TNF-alpha kit에서, 예를 들어 50배 희석이 가장 적당했으면 다른 kit를 쓸 때도 50배 희석해서 한다고 생각하면 될까요?
희석해야하는 배수가 cell과 kit 마다 큰 차이가 있는건지, 추출물마다 큰 차이가 있는 건지 궁금합니다..
할때마다 몇 배 희석이 가장 적절한지 항상 찾아야하는걸까요..??
-> 셀이 분비하는 cytokine을 detection하여 보는것이 ELISA이기때문에 셀과 추출물 모두 영향을 받아요. 기존에 activation햇을때 cytokine 종류마다 분비되는양도 각각 다르기 때문에, 셀이 트리트하는 추출물이 영향을 어떻게 주냐에 따라 또 양이 달라지죠. 논문에서 보통 나오는 값이 있다고하더라도 대략적인것뿐이라 직접 희석농도를 설정하셔야합니다.
****따라서 처음하는 ELISA kit일경우( IL-6, IL-1b, IL-8, IL-10 등) 모두 sample 희석 농도 설정을 위해 희석농도별로 걸어서 확인해야합니다.
키트가 아깝다면 control로만이라도 진행하세요
키트마다 희석비율 달라야합니다.
제 경험상 TNF-alpha는 상등액을 1X PBS로 50배 희석하여 진행했고
IL-6, MCP-1은 10~20배, IL-12는 원액으로 했었어요.
-
레벨1
예비대학원생s
(대학생)
-
22.06.07 13:34
답변 달아주신 분들 모두 감사드립니다!!!
이후에 알려주신대로 50배, 100배 희석하여 실험을 해봤습니다. 50배는 간당간당하게, 100배는 완전히 standard 범위내로 측정이 됩니다. (standard curve가 R^2값이 0.95가 되지 않아 다시 한번 해봐야겠지만요ㅠㅠㅋㅋ)
감사합니다~!
그리고 또 궁금한게
1. ELISA reader기 측정 값인 흡광도가 1이 넘으면 신뢰하기가 힘들지 않나요?
protocol에도 standard의 고농도인 700 pg/ml에서 흡광도가 2.252 정도로 표기가 되어있어서요...
제 실험 데이터도 sample의 O.D (450 nm)-(570 nm) 값이 50배 희석해보니 2.4~3.0, 100배 희석하니 1.2~1.7 까지 나타납니다. 꼭 1이하로 안해도 되는걸까요?
여러 사람들에게 물어보니 무조건 1이하로 값을 맞춰야한다 or 아니다로 나뉘어서 다른 분들은 어떻게 하시는지 궁금합니다!
2. 제가 NO assay에서 positive control로 L-NAME을 사용합니다. 마찬가지로 TNF-alpha에도 L-NAME 상등액을 가져오는데 NO assay에서는 NO 생성양이 확실히 줄어들어 효과가 있어보이는데, TNF-alpha 결과에서는 그렇지가 않습니다.
원래는 L-NAME 상등액을 TNF-alpha kit에 써도 줄어들어야하는거 아닌가요..?! 논문 찾아보니 positive control로 쓴 건 표기 안하기도 하고, allyl disulfide를 쓴 논문도 하나 봤습니다.
RAW264.7 cell로 NO assay하거나, TNF-alpha kit 사용하실때 positive control로 다들 어떤 걸 쓰시는지도 궁금합니다.
기초적인 질문인데도 감사히 글 남겨주시고.. 큰 도움을 얻었습니다!! 실험하다보니 자꾸 궁금한점이 생기네요ㅠㅠㅠㅎㅎ
감사합니다 :-)
-
레벨5
ʕ•ﻌ•ʔ뀨
-
22.07.12 13:32
sample의 경우 STD의 4배에서 8배희석하는 중간쯤으로 희석되게 하는걸 추천해요 ( OD 0.5 에서 1.0 사이)