실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Library
cDNA library에서 DNA size fraction 방법
cDNA library(Clontech) (비회원)
안녕하세요. 현재 cDNA library를 제작하려고 하고 있습니다. Clone tech Kit를 사용하는 대신 Kit에 나온 구성품을 보고 primer order하고 menual로 하고 있습니다. DNA size fraction은 Column 대신 일단 0.7% Agarose에서 50V 70 min 해서 1D로 Size fraction 하고 90도 돌려서 Low melting point agarose 부어서 2D Gel을 하고 있습니다. 문제는 EtBr을 Stainging하면 뒤에 해야 할 attB sequence를 붙인 다음 invitrogen BP reaction을 하는데 지장을 줄 것 같습니다. 그래서 현재 왼쪽은 마커를 걸어서 마커만 EtBr staining을 해서 Gel 사진을 찍은 사진과 실제 사이즈 비율을 구해서 cDNA 위치를 파악해서 Gel을 자릅니다. 처음에는 b-agarase를 썼는데 2D gel이라 덩치도 너무 크고 그래서 100unit enzyme을 너무 많이 사용하는 것 같아서 Qiagen Gel extraction kit를 사용합니다. 예를 들면 3kb 이하 size gel 무게가 3g 이면 그 3배에 해당하는 만큼 buffer(10ml)를 넣어주고 2개의 column으로 800ul씩 계속 elution을 시켜서 DNA를 회수합니다. 여기서 지금 문제가 발생하는 것이 (1) Size fraction을 하고 나서 Gel에 걸어 봤을 때 3kb 미만 만 정확하게 나오고 나머지 부분은 아예 나오지 않고 있습니다. (혹시라도 잘못 잘랐을까봐 나머지 부분을 EtBr staining 했더니 DNA band는 보이지 않았습니다. 즉 size 별로 정확히 자른 것입니다.) (2) 솔직히 marker 사진만 보고 자르는 것이 너무 힘듭니다. 요즘 EtBr 대신 나오는 Dye(SYBR 등등)을 사용해서 cDNA 을 stainging 하게 되면 뒤에 있을 BP reaction, LR reaction에 영향을 주는 것일까요?? (3) Column을 이용해서 cDNA를 Size freaction할 수 있는 kit 혹시 추천해 주실 것이 있나요??(<3kb, 3~5kb, 5~7kb, >7kb로 size fraction할 것입니다.) Kit사지 않고 하다보니 정말 힘이 듭니다ㅠㅠ Kit 사 달라고 할 수도 없는게 환율차이로 인해서 Kit가격이 어쩌구니 없이 비싸졌네요 ㅠㅠ cDNA library 잘 아시는 분은 Size fraction과 관계되어서 좋은 method 꼭 좀 추천해 주시면 정말 감사하겠습니다. 장문의 글을 읽어 주셔서 감사합니다.
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