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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 Primer design 관련 질문 부탁드립니다.
알호기심천국1(대학원생)  | 05.21 00:03
첨부파일 파일첨부: E.coli k12 prpE sequence.docx (17 KB)

안녕하세요
이번에 gene work 새로 시작하려고, primer design을 하게 되었는데요

제가 사용하려는 벡터(pSEVA321)의 MCS에 promoter가 없어서 클로닝 할 때 forward primer의 앞부분에 Promoter sequence(tac promoter, 29bp)까지 넣어주고자 하였습니다.
 

추가로 restriction enzyme site, meaningless sequence 등등을 감안하니 약 70bp정도의 forward primer가 나오게 되었습니다. 보통 primer 사용할 때 30bp 미만만 사용해봤는데, 이렇게 긴 primer도 사용할 때 문제가 되지 않으려나요...? 추가로, reverse primer의 길이는 약 30bp 나올듯 한데 forward, reverse 간의 길이 차 또한 걱정되는 부분입니다.

일단 제가 짠 프라이머의 gene 부분 서열은
Forward 5'-gtaaacggcggtaaggcgt-3'
Reverse 5'-ctactcttccatcgcctggc-3' 이고 GC contents는 각각 58, 61% 및 Tm은 61도씨로 동일합니다.

관련하여 파일까지 추가로 첨부하였습니다.

경험 많으신 선배 연구원님들의 조언 부탁드립니다. 감사합니다.

#Primer
 
#cloning
 
#PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  05.21 00:58  
70bp도 증폭에는 문제가 없지만 양쪽 Tm은 비슷하게 하는 것이 좋습니다.

PTac길이가 29bp인가요?
알호기심천국1  |  05.21 01:06  

네 tac promoter의 bp는 29로 알고있습니다! 현재 Tm값은 61로 동일하여 이대로 진행 해보도록 하겠습니다. 밤중에 감사합니다.

대왕개구리SPEED  |  05.21 09:22  

- Ptac을 사용하려면 29bp로는 힘듭니다.

 

- ATG 위의 upstream은 인식도 안되고 불필요합니다.

알호기심천국1  |  05.21 18:26  

ptac bp가 29라서 똑같이 넣어줬는데 안되는 이유를 알 수 있을까요??


atg upstream 넣어준 이유는 RBS부분을 넣어주기 위해 따왔습니다.

주말중에 감사드립니다.

대왕개구리SPEED  |  05.21 22:42  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
up stream 서열은 어디서 가져왔나요?

Tm이 같다고 하지만 2nd cycle 부터 F/R의 Tm 차이가 많이납니다.
알호기심천국1  |  05.22 01:42  

upstream 부분은 그냥 원래 template gene의 upstream부분에서 따왔습니다!
 

그리고 말씀해주신대로 생각해보니 2nd cycle 부터는 Tm값 차이가 좀 커지는 문제가 생기네요... Reverse primer 길이를 좀 늘려주어 Tm값 차가 2도씨 미만으로 되게 만들어주어 약 65~67도씨에서 annealing 되게 만들어주고자 하는데, elongation 온도가 보통 72도씨임을 감안할 때, annealing 온도와 큰 차이가 없게 되는데 이또한 큰 문제가 되지 않을까요..?

귀중한 주말에 친절한 답변 다시한번 정말 감사드립니다..!!

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