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 전체 > Cell Biology > Transfection
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질문 CRISPR-Cas9 하시는 선배님들 질문 드립니다
올챙이도비가공짜(대학원생)  | 05.17 13:32

안녕하세요 선배님들

 

저는 현재 석박통합 3년차 진행중인 도비이고 CRISPR-Cas9을 이용한 genome editing 실험을 하고 있습니다

 

CRISPR-Cas9으로 iPSC에 교정해서 라인 제작을 계속 하고 있는데, Donor Vector를 이용하여서 HDR을 진행할때 매우 높은 효율이 나왔고 라인 확보가 되게 쉬웠습니다.

그 다음으로 다른 라인을 제작하는 중 ssODN으로 디자인이 가능하여 진행을 하였으나 효율이 너무 극악으로 나오는 것 같더군요.

 

Donor Vector로 진행한 경우는 X Chromosome내 유전자 교정이었고 XY의 cell line이라 더 효율이 높게 나온 듯 하지만

ssODN으로 진행한 것은 hetero도 잘 안나와서 질문 드립니다.

 

ssODN으로 하는 건 원래 효율이 낮은가요?

낮다면 ssODN을 double strand DNA로 합성해서 진행하는 것이 좋을지 질문 드립니다.

#CRISPR-Cas9
 
#Genome Editing
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리bio  |  05.18 00:37  

donor vector를 이용한 경우 selection marker가 있으셨나요? 그러면 puro 같은 것으로 한번 selection을 하기 때문에 효율이 좋은 것으로 보입니다. 

ssODN mediated HDR의 경우 iPSC의 경우 보통 0.1-5% 효율이 나옵니다. 이건 케바케인데 효율이 좋지 않으면 정말 single clone 수백개를 따서 NGS 돌린 적도 있습니다. 

ssODN은 보통 modification시킨 것을 synthego에서 주문하시면 잘 되구요..

iPSC의 경우 viability가 낮기 때문에 electroporation (개인적으로 Lonza 것이 조금 더 잘 되더라구요 그래서 이 제품을 선호 합니다) 후에 ClonR2 (StemCellTech)를 ROCKi 대신 넣어 주면 그래도 어지간한 것은 다 됩니다. 

 

 

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