PCR을 배우고나서는 열심히 PCR을 진행중인 대학원생입니다.
실험하다 문득 궁금한 점이 생겨 이리 질문을 남깁니다.
같은 배양 조건에서 키우는 세포에 대해서, 특정 물질을 처리해서, 대조군과 비교를 한다고 가정을 해보겠습니다.
실험을 종료하고, 세포를 파쇄해서 RNA를 추출하고나서, 나노드랍 등을 통해 RNA의 양을 정량하고, cDNA를 합성을 할텐데요,
이때, 다른 연구자분님들께서도 cDNA 합성하는 과정에서 대부분 같은 양의 RNA를 넣어줘서 진행을 할 것으로 생각됩니다.
(제가 사용하는 cDNA합성키트의 경우 1μg/20μL로 진행하라고 안내되어있습니다)
그럼 실험군과, 대조군 모두 같은 양의 RNA양이 들어가서 cDNA가 만들어질텐데요, 결국 cDNA의 양도 실험군, 대조군 모두 같은 양이 합성되는거 아닌가요?
(물질에 의해서 독성이 있다고 가정해서, 실험군에서 세포가 더 죽어나간다 쳐도, 어찌되었든간에 실험군과 대조군 모두 최종 단계에서 수득한 RNA 전체량 중에서 cDNA 합성할 때 들어가는 RNA양은 똑같이 넣어주니까, cDNA양도 실험군과 대조군 모두 같다고 저는 생각되어지고 있습니다)
만약 맞다면, 여기서 궁금한 점이, housekeeping gene의 양도 두 실험군과 대조군 모두 같은 Ct가 나와야 정상 아닌가요?
House keeping gene(ex. GAPDH)은 어떤 특정 조건에 상관없이 세포의 생명 활동 및 기능 유지에 필수적인 구성 유전자라, 일정하게 발현되어서, 기준을 위해서 사용되어진다고 알고 있습니다.
그래서 지금 혼란스러운 부분은, cDNA양이 동일한게 맞다면 GAPDH와 같은 Housekeeping gene으로 상대정량 하는지 이해가 안갑니다. 이미 앞에서 양을 다 맞춰주고 시작했음에도 불구하고요.
실제 PCR을 해보면 같은 cDNA를 가지고 진행했음에도 실험군과 대조군 사이에 house keeping gene의 Ct가 차이가 나는지 이해가 안가면서 생긴 혼란이라, 이에 대해 제가 잘못 생각하고 있는 부분을 지적해주시기를 바라는 마음으로 이리 글 올려봅니다.
읽어주셔서 감사합니다.
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