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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 여러 유전자 클로닝
올챙이ziw(대학원생)  | 05.09 22:47

제가 클로닝을 처음 시도해보고 있는데 궁금한 것이 몇가지 있습니다..

 

1. 총 세가지 유전자를 클로닝해야하고 원래 크로모좀에는 이 세 유전자(a,b,c)가 한 방향으로 전사가 됩니다. 하지만 a와 b사이에는 약 100bp의 intergenic region이 있고, 논문을 찾아본 결과 bc는 operon으로 발현한다는 것 같습니다. 
그래서 a,b,c가 한 operon이 아닐 가능성이 높은데

여기서 a,b,c를 한번에 잘라서 vector에 삽입하고 발현시키는게 가능한가요...? abc가 한 operon이 아니어도, a의 promoter가 어디있는지 모르니 a 위에 200bp정도부터 잘라서 c의 종결코돈까지 잘라서 넣으면 발현이 제대로 될지 모르겠습니다 ㅠㅠ 알려주세요..

 

2. 그리고 보통은 유전자 사이에 rbs를 넣어주는 것 같던데 그렇게 안해도 발현은 가능한 거죠..?

 

*참고로 저는 과발현이 목적이 아니고 간단하게 이 protein이 항생작용을 하는지 확인하고자 native chromosome에서보다 조금 더 발현을 시키는 것이 목적입니다.

 

제발 도와주세요 ㅠㅠㅠㅠㅠ

#cloning
 
#co-expression
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  05.09 22:51  
promoter가 cloning host에서 작동을 하나요?
올챙이ziw  |  05.10 10:09  

원래 유전자가 사용하는 promoter 말씀이신가요?

대왕개구리SPEED  |  05.10 10:13  

- 예로 A의 promoter가 cloning host에서 작동하나요?

올챙이ziw  |  05.10 12:29  

흠.. promoter를 넣어준다고 작동하는게 아닌가요?

작동하는지 안하는지 알 수 있는 방법이 있나요 ?ㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  05.10 12:37  

- gDNA가 들어있는 cell과 cloning host cell은 각각 어떤 cell인가요?

올챙이ziw  |  05.10 12:41  

원래 native는 (gDNA) Paucibacter라는 균이구요

발현할 host로 사용할 균주는 E.coli BL21입니다.

대왕개구리SPEED  |  05.10 12:49  

- 가능할 수도 있고 안할 수도 있습니다.

 

- 어떤 vector를 사용할 지 모르겠지만 구성적으로 발현하려면 BL21 계열은

사용하지 않는 것이 좋습니다.

올챙이ziw  |  05.10 14:11  

'구성적으로'가 어떤 의미인가요?

참고로 저는 native에서보다 조금 더 높게 발현만 시켜서, WT과 cloning균주를 다른 균과 배양했을때 사멸 능력을 가지는지 보고 싶은 것입니다.

 

발현용 균주를 BL21으로 하는것이 왜 적절하지 않은건가요? 선택 기준이 궁금합니다 ㅠㅠ

올챙이ziw  |  05.10 14:12  

아 그리고 vector는 pRK415를 사용할 계획입니다

대왕개구리SPEED  |  05.10 14:51  

- pRK415는 lac promoter로 유도가 되어 over expression용이고 자체

promoter가 있기 때문에 ORF만 cloning하는 것이 좋습니다.

 

- pRK415를 사용하면 BL21을 사용해도 됩니다.

올챙이ziw  |  05.10 17:03  

pRK415벡터에 MCS가 lacZ안에 존재하는데 lac promoter가 제가 넣어줄 유전자 발현을 시킬 수 있을까요? MCS앞에 ATG 존재하여서 제 프로모터를 따로 넣어줘야하는 걸로 알고있는데 틀린건가요?

대왕개구리SPEED  |  05.10 17:28  

- pRK415는 원래 cloning용 vector지만 expression용으로도 사용은

가능합니다.

 

- lac promoter를 사용할 경우 

: a-fragment를 붙여서 발현 또는 a-fragment를 제외하고 발현 등 2가지 경우가 가능합니다.

 

- 자체 promoter를 사용할 경우 

: 자체 promoer + ORF를 전체 cloning하여야 하며 발현이 안될 경우 문제점

찾기가 조금 힘듭니다.

ziw  |  05.10 21:32   

1. a-fragment에 대해 찾아봐도 잘 안나오는데 어떤건지 설명해주실 수 있을까요?

 

2. lac promoter를 사용한다면 iptg로 induction해서 발현시키고, 자체 promoter를 사용하게 된다면 발현시키는 조건을 따로 잡지 않는다면 그냥 배양해서 어느정도 발현되는지 gel로 확인해보면 되겠죠?

3. 혹시 operon전체를 넣고 싶은데 regulator가 앞에 존재한다면 이것도 넣어줘야 promoter에 붙어서 유전자 발현이 시작되던 억제되던 하는건가요?

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