지금 성자님이 써주신거에는
DNA extration 과정이 안써있는데 dna extraction은 당연히 하신거겠죠.
NGS분석은 단순 세균 싱글콜로니 동정할때랑 같게 dna 를 추출하고 증폭하면 QC통과하기가 매우어렵습니다.
먼저 샘플에 total dan 추출할수있는 키트로 뽑아서 그 DNA추출한걸 NGS분석해주는 회사에 보내서 진행하면 QC통과할겁니다.
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심심해서
(비회원)
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22.05.05 00:28
이해할 수 가 없네요. Single cell NGS하는 마당에. 이런 경우도 돈을 받나요? ㅎㅎ
질문자님께서 임의로 증폭해서 증폭된 산물을 시퀀싱 보내셨다니 ㅜㅜ. 물론 NGS에 경험이 많다면 이해할 수 있지만....
업체와 상의해 보셔야 할 것같네요.
어떤 kit을 이용해서 library를 제작하는지. 그 kit에서 요구하는 DNA량 등 그리고 샘플 prep, purification step 등. 분명히 그 업체에서 사용하는 kit protocol에 low input DNA에 관련한 사항이 있을 것이고 디렉션을 줘야한다고 생각합니다.
몇 사이클로 증폭했는지 모르지만,
생각해 보세요. A가 우세하고 B, C, D 등이 적게 존재한다면
PCR 증폭으로 A가 월등히 많아져서 전체 분석에 영향을 줄 수 있습니다.
따라서 이러한 경우는 업체에서 적절한 증폭 후 라이브러리 제작을 맡아야 하는 부분입니다.
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레벨1
용용죽겠짛
(대학원생)
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22.05.06 10:56
니모님께서 DNA extraction을 했는지 여쭤보셨는데
당연히 샘플에서 Extraction을 진행한 후
나온 DNA를 가지고 pcr을 한 것입니다ㅠ
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레벨1
용용죽겠짛
(대학원생)
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22.05.06 10:59
심심해서님의 답변도 저희가 걱정하는 부분입니다ㅠ
제가 임의로 그냥 PCR product를 보낸 것은 절대 아니고 회사와 상의를 했을 때 분명 그렇게 진행해도 시퀀싱이 가능하다고 하셨기 때문에 pcr을 했던 것입니다….
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심심해서
(비회원)
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22.05.07 01:23
넵. 제가 말한 임의로 피씨알했다는것은
업체에서 말한 대략적인 사이클 수로 증폭 후 보내셨게지요.
하지만 작은 량의 DNA는 일반적인 나노 드랍에서 검출하기 힘들때도 많고 많은 오차가 날 수 밖에 없습니다.
따라서, Qubit같은 Fluometer로 측정하고, 이후 사이클 수를 확정하고 수행후 다시한번 추가로 증폭할 지 결정하는 1-step PCR이 필요합니다. 이 과정에서 첫번째 QC가 real time PCR로 진행됩니다. - 이것에 문제가 있다는 것인지?
이 이후의 과정 library prep.에서 문제가 발생한다면 님의 샘플 문제는 아니구요.
그리고, 제가 프로토콜을 요구해서 확인하라고 하는 것은 이 과정(첫번째 증폭)에서 대부분의 상용화된 라이브러리 제작 프로토콜을 인덱스를 넣게 되어있습니다. 물론 이후에 넣을 수도 있겠지만....
전체적인 프로토콜을 확인하지 않고서는
질문자님의 샘플이 문제인지
아니면 맡기신 업체에서 실수한 것인지. 알수없습니다.
따라서, 확실하게 무엇이 문제인지 물어보셔야 할 것 같습니다.