실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
PCR PREP 효율 높이기
레벨3 고로쇠물 (대학생)
RT-PCR 실험에서 prep 가 자꾸 ct값이 낮게 나오는데 (이론상 23ct 실제는 27) 어떻게 해야 ct값이 높아질수 있을까요?(균주는 BADV 정량 실험입니다) 저희는 일단 spin column 방식으로 dna 추출합니다. 균주는 보통 200㎕에 Proteinase K 20㎕에 BA buffer 200㎕ (아마 Lysis buffer일종) 혼합해서 Incubator 60℃ 10min 하고 99% ethanol 400㎕ 넣고 Pipetting 하는데 여기서 저는 Pipetting을 겁나 하면 DNA가 좀더 뭉치지 않을까? 생각해서 많이 해보기도 하고 조금하기도 하는데 실험실 제약이라고 해야할지... 어러 시도를 하기에 지원의 한계가 있어서 자료 수집을 많이 못했어요 저는 5번이 적절?하다 생각은 들었는데 아직 확실한 증거가 부족하네요. Binding column tube넣었을 때는 WA1 500㎕랑 W2 500㎕ 8000rpm, 1min 씩 하는데 마지막에 column에 buffer 남아있으면 안되잖아요? 그래서 공회전 13000rpm, 1min 하는데 저는 드는 생각이 1분 충분한가? 생각도 들어요. 근데 3분하다 dna다 잃으면......그리고 EA buffer을 200㎕ 넣는데 원래 DNA 잘 추출 안나오거나 옅으면 EA buffer 줄이잖아요 그래서 100㎕만 쓰려고 하는데 될까요? 정량분석이라 DNA농도를 억지로 높이는것 같아서 이 방식을 해도 되는지... 의문이네요. 그리고 요번에 새로 생각한 방식인데 추출한 prep를 spin down하면 상층액과 하층액의 DNA농도가 몰린다고 했는데 그래서 저는 생각한게 일부러 spin down해서 하층액 100㎕를 실험에 써서 희석해서 정량 분석하면 좋지 않을까 생각도 했지만 그러면 이게 순수 정량이 맞는지 걱정됩니다. 아직 학부생이라 실험을 막 할수 있는 환경이 아니라 조언 얻고 싶네요 ㅠ
Bio마켓 프리미엄