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질문 DAB staining 1차항체 안붙인샘플에서도 발색이 됩니다ㅠ
올챙이12312(대학원생)  | 2022.04.26 23:09
첨부파일 파일첨부: 1D8FFAF9-3AD3-403D-8356-782A4771CBC7.png (501 KB)
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이전에도 질문했긴한데, 다른 문제로 질문을 또 올립니다ㅠ

1차항체로 ki67을 붙여 hair follicle 관찰이 주 목적이고,
왼쪽 사진은 negative control용으로 1차항체 대신 5%BSA를 붙여 o/n 후, 2차는 동일하게 (2시간30분 반응) 진행하였습니다. dab(vector)시약은 10분 처리하였습니다.

1. 오른쪽 1차붙인 사진 보면 갈색점점이 있는 걸 보아 염색이 안된 건 아닌것 같은데 negative에선 단지 비특이적으로 염색이 된 걸 까요? 혹시 그렇다면 이유가 뭘까요ㅠ

2. 한날한시에 같이 진행한 염색인데 왼쪽오른쪽 사진 발색이 너무 달라서 황당했습니다. 샘플수도 5개 밖에없었어서 염색하면서 delay는 거의 없다고 봐도 되거든요.. 왜그렇죠ㅠ

3. 디지털슬라이드스캐너(image scanner)로 촬영하는데 원래 현미경상으로 볼때 아주아주 연하게 뜨나요? h&e샘플 촬영때는 현미경 auto focus하면 자동인식 아주 잘됫는데 dab샘플들은 너무 연해서 잡히지가 않았습니다. 원래 이런가요..?
#DAB
 
#immunohistochemistry
 
#immunostain
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리토라  |  2022.04.27   

1. Blocking은 어떤걸로 하세요? 저희는 0.2% Triton X100 + 1% BSA RT 1시간처리합니다.

2. Blocking 전에 조직을 3% 과산화수소수로 5분정도 반응시켜주시나요?

해당반응을 거치지않을시 Endogenous Hydroxylase가 조직에 남아있는데 그에 의해서 DAB염색할때 쓰는 과산화수소와 반응을 하여 아무것도 처리하지않아도 Nonspecific 하게 염색이 될 수 있습니다.

3. 2차항체 Biotinylated antibody를 사용하시나요? HRP를 쓰신다면 DAB 발색할때 반응은 합니다만 H2O2에 의해 방해가 될수있으며 Biotinylated Antibody를 쓰신다면 ABC solution(Vector제품) 쓰신 후 DAB을 하신다면 더 진하게 시그널을 증폭시킬 수 있습니다.

저희도 조직 Axioscan으로 촬영합니다만, DAB에 담가둔 시간이 너무 짧아서 발색이 덜된게 아닌이상 연하게 보여도 Z-stack으로 찍거나해서 충분히 진하게 보일 수 있는데, 당초 포커싱이 안맞아서 연하게 보일수도 있습니다.

제가 사진만 봤을때는 연해서 Exposure time을 너무 끌어올리신건지 너무 밝게보이네요. 그리고 저희는 DAB을 담그면 1차 안티바디를 안붙이더라도 조직자체는 갈색으로 은은하게 전반적으로 띄게되는데(조직 색감 자체가 그렇게 변하는것이지 1차 붙이지않은 이상 Cell이나 nonspecific은 안보임) Brain이라서 다른 조직에선 어떻게 보일지 모르겠습니다..

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