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웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
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 전체 > Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
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질문 Annexin V / PI or 7aad apoptosis 실험 질문입니다.
알Jellyjaelee(대학원생)  | 04.12 00:22

안녕하세요?

처음 질문 올려보는 석사 1년차 대학원생입니다.

다름이아니라 제가 FACS를 통한 Apoptosis 실험을 시작하고 있는데 도저히 답을 얻을 수 없어서 질문을 드립니다...

우선 cell line을 이용하여 Annexin V/PI or 7AAD staining을 하고 있습니다.

다만 약물을 treatment하지 않은 DMSO만 처리한 control cell 에서도 FITC staining이 확연하게 관찰되고, 심지어 DMSO를 처리하지 않은 live cell에서도   Annexin V-FITC가 염색이 됩니다...

FACS기기는 Beckman Coulter cytoflex를 사용하고 있으며 Annexin-V 및 Annexin-V binding buffer, cell staining buffer는 모두 Biolegend 제품을 사용하고 있습니다.

adhesion cell을 수거할 때 Trypsin을 이용하여 harvest하는데 harvest직후 측정해보면 dead cell population이 심각하지는 않지만, cell staining buffer로 2회 wash 후 Ab를 처리하여 측정하면 FSC SSC에서 Dead cell population이 Live cell, Dead cell 모두에서 동일하게 측정됩니다ㅠㅠ

cell line을 바꿔도 비슷하게 측정되어, 왜 live cell에서도 Annexin V-FITC positive하게 나오는지 해결 방법은 어떻게 해야하는지 여쭤봅니다..

가능한 모든 경우의 수를 측정해보았지만 해결이 되지 않습니다ㅠㅠ

고수님들의 조언 부탁드립니다...

 

사진은 순서대로 어디서나 두개의 population을 보이는 cell line들..

unstaining 대비 모두 FITC positive 하게 나타나는  cell 들

마지막으로 Live cell에서도 모두 positive하게 나타나는 cell 들 입니다ㅠㅠ

upload_image

 

#AnnexinV
 
#apoptosis
 
#annexin v
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리무광  |  04.12 00:27  

장치 voltage 값이나 compensation 쪽을 생각해보셔야 할 것 같네요

알Jellyjaelee  |  04.12 00:30  

답변 감사드립니다!

Compensation은 compen후 histogram overlay를 확인해보니 침범하지 않는 것을 확인했습니다..! FACS 초보라서 voltage를 잘 확인하지 못할 가능성도 있지만 FITC값을 내려보아도 결국 전체적으로 이동하여 염색이 된 결과는 변하지 않는 것 같습니다

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