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질문 Flow cytometry; Fixation/Permeabilization 시, Live cell이 너무 많이 감소합니다,,
알타타(대학원생)  | 03.27 21:47

안녕하세요. 약 1년 간, flow cytometry 조건을 잡고 있는 대학원생입니다..

주변에 조언을 구할 곳이 없어, 계속 구글링하다가 질문 드리게 되었습니다.

 

저는 마우스에서 primary cell을 분리한 후, flow cytometry로 분석하고 있습니다. 세포를 분리한 후에는 총 두 개의 그룹으로 나눠 staining을 진행합니다.

1. 2개의 surface staining.

2. 1개의 surface staining -> Fixation/Permeabilization -> 1개의 intracellular (nucelar) staining.

Staining을 하기 전까지의 모든 과정은 동일하게 진행합니다.

Fixation/permeabilization 단계에서는 'eBioscience™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set' 제품을 사용하여 4℃에서 O/N 한 후, 다음날 intarcellular staining을 진행합니다.

 

제가 질문 드리고 싶은 부분은 surface staining만 한 후, 7aaD를 이용하여 live cell을 gating하면 약 90 ~ 95% 정도가 live cell인 반면, fix/perm 과정을 거친 후, live cell을 gating하면 50~70%만이 live cell이라는 점입니다. (Fix/perm하는 sample의 경우 live/dead Ab를 이용하여 staining합니다.)

이렇게 까지 live cell이 감소하는건 제 실험방법에 문제가 있는 것 같아서요.. 다양한 조언을 부탁드리고 싶습니다..

 

또한 Fix/perm을 하면 cell debris가 많아진다고 들었는데 약 1X10^6개의 cell을 염색할 경우, flow cytometry에서 모든 샘플을 다 읽혀봐도 total events 수가 1X10^6개에 가깝게 나타나는데, stainging 과정에서 저도 모르게 loss를 많이 내고 있는 것일까요..

 

읽어주셔서 감사합니다:)

#flow cytometry
 
#fixation
 
#permeabilization
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
456  |  03.28 08:30   

fixation, permeabilization을 하면, cells은 당연히 죽어 있는 상태이고요.

 

FSC/SSC 에서 cell population의 변화는 어떠한가요?

live/dead Ab -> live/dead anbitody 인가요? 구체적으로 무엇을 사용한 것인가요?

 

알타타  |  03.29 00:17  
첨부파일 파일첨부: FSC vs. SSC.jpg (239 KB)
이미지 첨부파일

Fix/perm을 하면 세포가 죽는다는 것은 알고 있습니다. 다만 live cell을 gating 하기 위해 fix/perm 과정 이전에 live/dead antibody(ebioscience, Fixable Viability Dye)를 이용하여 live cell을 gating하는데, 이 경우에 세포의 viability가 많이 감소하는 것 같아 질문을 드렸습니다.

 

FSC/SSC plot의 변화도 나타납니다. 말로 설명하기 어려워서 파일로 첨부하겠습니다. 조언 부탁드립니다..

개구리Coolzinc  |  03.29 11:05  

저는 해당 키트로 O/N은 안해봐서 잘 모르지만 보통 60min 정도 반응 시킨

후 ICS를 진행합니다. 

혹시나 Condition이 떨어진 TIL같은 primary cell에서는 Fix/Perm에 의한 

damage로 dead cell의 비율이 늘어날 수 있을 것이라 생각되는데 

Fix/Perm 반응시간을 좀 줄여보시는 것은 어떨까요? 

개구리아이고야  |  03.29 11:51  
저도 fix perm 을 자주하고있는데, 오버나잇으로 해본적은 없습니다. 당일날 fix perm 마치고 염색 후 당일날 기기로 읽지못한적은 있어도요(염색 후 4도씨에 두고 다음날 읽어도 문제는 없었습니다.) Live dead dye 를 사용해보진않았습니다.
456  |  03.29 13:26   

우선 용어 부분에서, 사용한 시약은 dye이지 antibody가 아닌걸로 판단됩니다.

 굳이 O/N할필요가 없을텐데, 1시간내외로만 staining해서 해보시길 바랍니다.

보다 정확하게 진단을 하려면, original file을 들여다 보면서 다 비교를 해봐야 하고요.

 

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