실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
PCR product smearing 현상
레벨3 김아무개석사과정 (대학생)
pcr product가 전체적으로 smear 현상이 너무 심하고 아예 증폭이 안되는 경우가 있어서 질문드립니다..
약 120bp 크기의 band가 나와주어야 정상입니다. (사진에서 맨 아랫쪽 band)
원래 PCR 조건은,
95도 2분
95도 30초
60도 30초
72도 15초
72도 5분
입니다.
처음 8개 ladder는 anealing 온도를 2도 높혀준 것이고
그 뒤 8개 ladder는 3rd PCR을 수행한 것이며 (2nd PCR product를 1ng/ul로 희석)
그 뒤 8개 ladder는 raw 샘플로 1차 PCR을 수행한 것입니다.
1. 전기영동시 TAE buffer도 fresh 한 것으로 바꾸워주었고,
2. anealing 온도도 높여봤습니다. (60도 -> 62도)
3. negative에서는 아무것도 뜨지 않았습니다.
4. 새로운 template를 해서 PCR을 수행했을 때에는원래 증폭되던 샘플이었으나 이번 실험에선 아예 증폭되지 않았습니다.
샘플 특성상 inhibitor 가 많은 것이 특징입니다..
계속 시도할 수록 결과값이 점점 더 안좋아지는 것 같습니다.
처음 몇번 실험할 때는 band가 어느정도 깔끔하게 나왔었는데..;;
혹시 DW가 문제일 수도 있을까요?
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