실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > Small RNA Analysis
siRNA Santa transfection이 잘 안됩니다. 도움을 요청드립니다 (Protocol첨부)
레벨2 꿈많은청년 (대학원생)
안녕하세요. 최근 siRNA실험을 진행하고 있는 대학원생입니다.
siRNA 프로토콜을 열심히 숙지하고, siRNA에 대해서 공부하면서
처음으로 siRNA실험을 진행하고 있습니다만, Transfection이 잘 안되고 있습니다.
실험 초반, Gene Down이 된 것을 확인하고, 이 후 실험에서는 계속 Gene Down이 잘 되지않아
처음에는 siRNA의 실험을 자주하면서 활성도가 떨어졌을거라 가정도 했지만
제 실험방법에 문제가 있을 것 같다고도 생각하면서
브릭에 계신 연구원 선생님들의 지혜를 꼭 구하고 싶어서 이렇게 글을 씁니다.
내용이 길고 복잡하더라도, 도움주시면 저도 꼭 훌륭한 연구자가 돼서 많은 도움을 줄 수 있는 선배 연구자가 되겠습니다.
제가 사용하는 siRNA Protocol 입니다.
siRNA Protocol내용 중
1.Prepare the following solutions: Solution A: For each transfection, dilute 2-8 µl of siRNA duplex (i.e. 0.25-1 µg or 20-80 pmols siRNA) into 100 µl siRNA Transfection Medium: sc-36868. 항목을 수행하기 위해
Target Gene에 대한 siRNA 시약(siRNA duplex)을 구매했고, Data sheet에 나와있는 Resuspension을 참고하여
[Resuspend lyophilized siRNA duplex in 330 µl of the RNAse-free water provided. Resuspension of the siRNA duplex in 330 µl of RNAse-free water makes a 10 µM solution in a 10 µM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA buffered solution] <- (Target siRNA Data sheet내용)
설명서대로 구매한 Target siRNA 파우더에 함께 제공된 RNAse-free water 330 µl를 넣었습니다. 그 후, siRNA Protocol을 참고하여 위에서 만든, siRNA duplex 8 µl를 따서 siRNA Transfection Medium: sc-36868 100 µl에 섞었습니다.
2.Solution B: For each transfection, dilute 2-8 µl of siRNA Transfection Reagent: sc-29528 into 100 µl siRNA Transfection Medium: sc-36868. Peak activity should be at about 6 µl siRNA Transfection Reagent. 항목을 수행하기 위해
siRNA Transfection Reagent: sc-29528를 구매하여 100 µl siRNA Transfection Medium: sc-36868에 8 µl를 따서 섞었습니다.
3. Add the siRNA duplex solution (Solution A) directly to the dilute Transfection Reagent (Solution B) using a pipette. Mix gently by pipetting the solution up and down and incubate the mixture 15-45 minutes at room temperature. 3번 항목을 수행하기 위해
1번과 2번에서 만든 시약을 섞고 30분동안 상온에서 반응했습니다.
혹 제가 놓치고 있는 부분이나
잘못된 방법이 있다면, 선생님들의 지혜를 구하고 싶습니다.
다른분들도 도움이 될 수 있기에 글 삭제 안하겠습니다!
siRNA_Protocol도 첨부하였습니다.
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