실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
Transfer가 갑자기 안되는데 이유를 못 찾고 있습니다.
레벨5 IMMB (대학생)
저희 실험실에서는 Anode 1, 2 buffer 및 Cathod buffer를 사용하여
semi-dry W.B를 하고 있습니다.
예전부터 해오던 방식, 조건 등으로 W.B를 해오고 있었는데
갑자기 Transfer가 안되서 곤란한 상황입니다.
원래하던 transfer 조건은 PVDF membrane 2장 기준으로 100V, 90mA로
1시간 25분 정도하고 있었습니다.
1. 사용하던 변압기로 SDS-PAGE는 잘됨
2. 완전히 다른 브랜드의 seni-dry W.B 기기로도 transfer가 안됨
그래서 기계문제는 아닐거라고 생각했습니다.
3. buffer를 새로 바꿔봄
4. working buffer를 제조하거나, 3M paper, membrane, gel의 쌓는 순서가
잘 못 됐나 싶어 제가 실험하는걸 선배가 옆에서 봤는데도 문제가 없었음
5. 전압을 120mA까지 올려봄
하지만 결국엔 전부 transfer가 되질 않았습니다
6. membrane에 항체(Beta-actin)도 붙여봤지만 아무것도 나오질 않음
사진은 transfer 후에 gel을 staining한거구요, 원래 하던 조건으론 gel에
단백질이 남아있지 않았지만 사진을 보면 단백질이 많이 남아있습니다.
첫번째사진에 선을 그린 라인을 따라서 뭔가 문뗀것 같은? 흔적도 있구요
제 생각으로선 도저히 어디가 잘 못 됐는지 알 수가 없습니다..
잘해오던게 갑자기 이러니 문제점 찾기가 더 어려운 것 같습니다.
어느 부분이 잘 못 됐는지, 혹은 의심가는 부분이 있는지 조언 부탁드립니다.
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