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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
조회 271  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 sequencing 관련
올챙이간첩신고113(대학생)  | 01.10 20:04

 4도에서 6개월 정도 보관된 template DNA를 활용하여 PCR 수행 후 sequencing을 시도했었습니다.

 

Forward 방향은 잘 읽었으나 Reverse 방향의 경우 제대로 읽지 않았습니다..

peak가 매우 낮거나 들쑥날쑥 섞였습니다..

 

같은 sample을 활용하여 3번 재실험을 시도했었는데, 1번은 reverse 방향을 깔끔히 읽었던 것을 확인하였습니다.

 

-primer농도는0.5ng/ul 사용중입니다.

 

잘 못읽은 것에 대하여,

 

1) 혹시 elongation 시간이 너무 짧은건가요?

elongation 72도 1분

final elongation 72도 5분

입니다.

 

2) 본문에 나와있는 것과 마찬가지로 좀 오래된 template를 활용해서 그런지?

 

감사합니다.

#sequencing
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.10 20:38  

- 혹시 elongation 시간이 너무 짧은건가요?

: sequencing을 직접했나요?

어떤 PCR반응인가요?

 

- primer는 어떤 것을 사용했나요?

글작성자  |  01.10 22:21   

Sequencing은 업체에 맡겼습니다.

직접 design한 primer를 활용하였고, 일반적인 PCR입니다.

 

PCR product를 확인했을 때, 원하는 밝기와 크기의 band를 얻었고,

업체에 맡길 때, gel extraction을 부가적으로 요청하여 sequencing 맡겼습니다.

대왕개구리SPEED  |  01.10 23:22  
질문자의 PCR 조건과 염기서열분석은 관계가 없습니다.

잘 분석된적이 있으면 정제문제로 보입니다.
알alcasave  |  01.11 20:56  

체크해봐야 할 것들이 매우 많을 것 같습니다.

1. 우선적으로 PCR 기계 자체의 문제도 발생할 수 있습니다. 기계 노후화에 따라 기계에 표시된 온도와 다르게 정확히 해당 온도에 도달하지 못하는 경우도 발생할 수 있으므로 본인 외의 다른 실험자의 데이터가 잘나오는지 확인하여 기계 문제인지 생각해볼 필요도 있습니다.

2. PCR과정에서 사용하는 polymerase의 조건을 확인해보세요. polymerase마다 온도 조건의 차이가 있을 수 있으므로 activation 온도를 확인해보세요.

3. elongation의 경우 product size를 고려하여 변경할 수 있습니다. 보통 1kb당 30초 길게는 1분을 기준으로 설정하면 됩니다. product size를 다시 계산해보시고 이에 맞는 elongation 시간을 설정하시길 바랍니다. final elongation의 경우 5min이면 충분하나 product size에 따라 7min을 진행하기도 합니다.

4. primer 제작에서 어떤 사이트를 활용하였는지는 모르겠으나 우선 primer 끼리의 dimer 형성 여부(상보적 seq 결합여부) 확인과 TM값 재확인도 해볼 수 있을 것 같습니다. 또한 reverse에 대한 값이 잘 안나오므로 reverse primer의 주문과정에서 seqence 입력오류가 있는지 확인해보는 것도 좋을 것 같습니다.

 

개인적인 생각으로 forward가 잘 읽혔으므로 template가 오래되어 발생한 문제라고 하기는 어려울 것 같습니다. elongation 시간도 크게 문제가 될 건 없어보입니다. 지속적으로 잘 안되는 경우에는 reverse primer를 다시 제작하는 것이 가장 좋을 것 같습니다.

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