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 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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질문 Transformation colony가 안 떠요
알임떠떠(일반인)  | 01.10 10:52

안녕하세요!

지금 Listeria Cloning을 진행하고 있는데

colony가 안 뜹니다..벌써 4번째 실험인데..

CP cell은 DH5α 사용중이고 효율 확인은 했습니다.

Ligation에 사용한 vector도 확인 완료했고,

Insert DNA 농도도 충분하고 전기영동으로 확인도 했습니다.

Spreading 후 LB amp 배지에서 37℃에서 16시간

(Incubator 온도도 확인했습니다)

배양 했는데 동시에 실험 진행한 다른 균주들에서는 문제가 없는데

현재 Listeria에서만 colony가 안 뜹니다.

검색을 해보던 중 Listeria 감염 항생제로 ampicillin을

사용한다는 글을 보았는데 혹시 ampicillin을 사용해서

형질전환 된 Listeria까지 죽어버린걸까요?

#Listeria
 
#ampicillin
 
#colony
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  01.10 11:14  

cloning host로 Listeria를 사용했다는 말씀이죠?

그러면 Listaeria 를 그냥 ampicillin 배지에 깔아보세요. 

알임떠떠  |  01.10 11:16  

네 host로 Listeria를 사용했습니다!

Listeria DNA를 배지에 깔아보라는 말씀이신가요?

대왕개구리SPEED  |  01.10 12:23  

- CP cell로 DH5a를 사용하낟고 나왔있는데 질문을 정확히 해 주세요.

 

- Listeria를 CP cell로 사용했다면 어떻게 만들었나요?

 

- TF vector는 어떤 것을 사용했나요?

알임떠떠  |  01.10 12:44  

현재 TA cloning을 진행중이고

CP cell : DH5α (pUC19)

Insert : Listeria DNA

Vector : pCR4-TOPO vector

사용했습니다!

 

대왕개구리SPEED  |  01.10 12:56  

- DH5a(pUC19)는 어떤 뜻인가요?

 

- insert는 어떻게 준비했나요?

알임떠떠  |  01.10 13:23  

DH5α가 E. coli예요

pUC19가 DH5α인 플라스미드 이름이구요!

대왕개구리SPEED  |  01.10 13:56  

- 그걸 몰라서 질문을 올렸겠습니까?

 

- CP cell에 plasmid가 있는 걸 왜 사용했는지가 질문입니다.

 

- 그리고 insert는 어떻게 준비했나요?

필요한 답변이 있어야 문제점 해결에 도움이 됩니다.

알임떠떠  |  01.10 14:39  

- CP cell에 plasmid가 있는 걸 왜 사용했는지가 질문입니다.

Transformation 후 single colony를 액체배양하여

plasmid DNA를 추출하기 위해서 사용하였습니다

- 그리고 insert는 어떻게 준비했나요?

Insert는 Listeria DNA를 PCR 후 전기영동하여

Gel elution하였습니다 

개구리SCIENTIST00  |  01.13 18:33  

CP cell : DH5α (pUC19)

Insert : Listeria DNA

Vector : pCR4-TOPO vector

무슨 이유인지 모르겠지만 pUC19가 들어 있는 DH5a는 현재 사용하려는 pCR4-TOPO vector를 받아드릴 수 없습니다. pCR4-TOPO vector가 pUC origin을 갖고 있기 때문입니다.

어떠한 plasmid도 들어있지 않은 CP cell을 구입해서 사용하세요

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