[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
머크
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
BioLab 박소정 교수
전체보기 안전점검 LABox
 전체 > Molecular Biology-DNA > etc.
조회 1075  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 plasmid 제한효소 처리 질문드립니다!
뒷다리ㅇㅋㅇㅋ(대학원생)  | 2021.12.20 15:23
첨부파일 파일첨부: 전기영동.JPG (23 KB)
이미지 첨부파일

제한효소 처리 후 전기영동 결과를 첨부해두었습니다.

complete sequence 분석이 완료된 균주의 plasmid 확인 중인데요

 

NEB cutter로 분석된 plasmid 서열을 넣어 1-cut 제한효소 확인

-> prep 후 제한효소 각각 따로 처리하여 전기영동 결과 확인

-> 결과) lane 2 : A, B 모두 1-cut이나 B cutting X

            lane 3 : A만 1-cut이나 cutting X

            lane 4 : B만 1-cut이나 cutting X, A cutting O

 

위와 같이 실험 진행했고 결과를 분석했는데요..

업체에서 분석 중 문제가 있었던걸까요?

아니면 제한효소 처리를 제가 잘 못 한걸까요ㅠ

업체측에 문의했을때는 이상이 없다고만 하셔서 답답하여 질문올립니다ㅠ

 

추가로 제한효소 처리 후 항상 밴드가 더 흐릿하게 퍼지는데 원인이 뭘까요..?

처리하지 않고 띄웠을 때는 또렷하게 나오는데 항상 처리 후에는 약간 흐릿하게 번져서 나옵니다

 

미리 감사인사드립니다!

#plasmid
 
#restriction enzyme
 
#electrophoresis
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2021.12.20   

- A, B plasmid는 전체 염기서열 분석이 끝났나요?

 

- A, B 모두 안잘리는 것으로 보입니다.

뒷다리ㅇㅋㅇㅋ  |  2021.12.20   

SPEED님 안녕하세요!

 

- WGS 분석 완료한 상태입니다!

- A, B 모두 서열 정보에 따른 제한효소 처리 결과가 맞지 않는 것 같은데 업체측에서 다시 확인해줘야하는 부분이 맞겠죠?

대왕개구리SPEED  |  2021.12.20   

- plasmid 서열을 알고 있다면 각 plasmid를 분리해서 primer를 합성한 다음

다른 업체에서 염기서열 분석을 해보세요.

 

뒷다리ㅇㅋㅇㅋ  |  2021.12.20   

SPEED님 답변 감사드립니다!

 

말씀해주신 방법도 시도했었는데요ㅠㅠ

 

gel extraction 후 band 추출하였을 때 우선 농도가 매우 낮았고

추출 후 농축하여 발송해도 반응이 안되었습니다ㅠ

(제작 primer는 plasmid 2개가 혼합되어있을 때는 반응되어 문제가 없는 것 같습니다.)

 

업체 측에 문의하였을 때는 pcr product가 아니면 gel extraction service는 제공하지 않는다고 하시더라구요...

그래도 한번 부탁드려서 진행해주셨는데 업체측에서 진행한 결과도 여전히 농도가 낮았습니다.

 

gel extraction 외에 특정 plasmid만 추출할 수 있는 방법이 있을까요..?

조언 부탁드립니다... 감사합니다!

대왕개구리SPEED  |  2021.12.20   

- elution이 잘 되는데 이상하네요?

 

- 농도가 낮아도 왠만하면 염기서열 분석 반응으로 1kb 정도는 충분히

읽을 수 있습니다.

 

- 1개 plasmid 씩 별도로 읽어야 하기 때문에 혼합했을 때 primer가 잘 붙는

다고 해서 별 의미가 없습니다.

 

- plasmid양은 얼마나 나오나요?

 

뒷다리ㅇㅋㅇㅋ  |  2021.12.20   

- plasmid양은 얼마나 나오나요?

  보통 plasmid prep 시 약 100ng/㎕ 농도로 20㎕ 가량 추출하고 있습니다

  B band를 gel extraction 시 column type으로 추출하면 농도가 1/20 가량으로 줄어서 bead type의 kit으로 추출하고 있습니다

  물론 bead type kit도 1/6 가량으로 줄어서 농도가 매우 낮긴 한데요...

  추출 후 농축은 speed vac과 EtOH ppt로 진행해보았는데 둘 다 sequencing에 실패했습니다ㅠ

   column type에서 추출하기에는 너무 비효율적이라...

   bead type 사용 시 glass milk를 최대한 제거한다고하는데... 이 kit을 사용하는게 문제일까요?

대왕개구리SPEED  |  2021.12.20   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- bead type이든 filter type이든 ge을 녹여 silica에 붙인 후 elution하기 때문에

원리 상 동일합니다.

 

- gel elution 방법은 여러가지가 있습니다.

bead type, filter type, LM agarose, 냉동/해동법, eletroelution, diffusion법 등

 

뒷다리ㅇㅋㅇㅋ  |  2021.12.20   

다른 방법으로도 추출 진행해보겠습니다!

답변해주셔서 감사합니다 SPEED님!!

답변하기
할인행사/신제품신기술 광고 검색광고
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
Celvivo Demo모집! Request Form작성 후 신청시 80만원 상당 Celvivo Start K.. (12.28까지)
바이오클론 바이오클론
Biolegend 한국대리점 Biolegend 30% 할인행사 (12.30까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
Azure Trade In Event!최대 40%할인 (12.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
스트레스없이 3D 세포를 배양해보세요!!
몰레큘러디바이시스코리아 몰레큘러디바이시스코리아
플레이트리더기 최대 40% 할인 (12.26까지)
바이오닉스 바이오닉스
[TECAN No.1 한국공식대리점] TECAN Automation / Liquid handler / Mic.. (12.31까지)
최근등록   더보기 >
L6 계대 관련 질문입니다ㅠㅠ   12.06
L6 계대 관련 질문입니다ㅠㅠ   12.06
Working volume   12.06
SDS-PAGE gel running buffer재사용   12.06
잘 뭉치는 cell culture 법   12.06
western blot 샘플을 ELISA에 사용 가능할까요?   12.06
Kaplan meier 분석에서 두 그룹간 비교하여 그래프 그릴 때 정의역 문제   12.06
DNeasy Plant Mini kit 관련   12.06
cell culture 이물질 형성   12.06
LC로 Nd2O3분리   12.06
최근답변자 우수답변자
올챙이쥐팤

알잘뽑고싶어요

개구리오이가싫어

올챙이CBD 김선..

대왕개구리SPEED

개구리Marine

올챙이텔루르

뒷다리BBlue

꽃개구리Kozmoj

꽃개구리bio

개구리Lucid

개구리Daegu*

개구리지나가는사람

대왕개구리엘피스

꽃개구리Applied_Mi..

꽃개구리Jake

실험관련연재
세오 연재중실전 실험 프로토콜 101
세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고