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웹진 Vol.23, No.12 (2021년 12월) 발간
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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 SDS PAGE를 했는데 결과가 이상한 것 같습니다..,SDSPAGE고수님들 부탁드립니다ㅠㅠ!!
알대학생입니당(대학생)  | 11.20 23:33

안녕하세요?

upload_image

SDS-PAGE 결과에서 맨 처음은 size maker이고 처음은 IPTG를 cell에 induction하여 eGFP를 포함한 plasmid를 발현시키기 전인 induction 전 상태이며 그 다음은 induction 후입니다. 그리고 그 다음은 affinity chromatography를 이용하여 eGFP를 정제하기 위한 실험을 한 wash와 elution buffer에 대한 것입니다.

제가 여쭙고 싶은 것은 induction전에 대부분의 단백질이 cell에 있으므로 대부분의 marker가 떠야한다고 예상하고 있었는데 놀랍게도 아무 것도 뜨지..않은 것 같다고 파악했습니다.

이번이 SDS PAGE처음인데 거의 어떤 밴드도 뜨지 않았다고 보는 것이 맞는 것인지..또 왜 induction전에는 없다고 뜨는데 induction후에는 있다고 뜨는지..그럼 eGFP를 제외한 나머지 밴드들도 후에서는 뜨지 않아야 하는게 맞지 않아야하는게 아닌지 싶습니다. ㅠㅠㅠ

 

읽어주셔서 감사합니다. 답변 주시면 정말 감사할것같습니다.

#SDS-PAGE
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  11.21 00:56  
발현전 시료 단백질양이 적습니다.

얼마의 균을 얼마의 buffer에 lysis했나요?
청개구리Leleuta  |  11.21 01:42  
밴드가 옅을뿐인것같은데..
알대학생입니당  |  11.21 10:23  

seed culture 때 media와 bacteri를 1000대1로 넣은거같습니다.

만약에 밴드가 옅거나 단백질 양이 적은거라면

왜 induction후와 차이가 저렇게 큰 차이가 날 수 있는건가요?

eGFP만 차이가나야하지 않나요??

감사합니다!

개구리레몬민트  |  11.21 12:27  

induction 할 때 cell이 아예 늘어나지 않는 것은 아닙니다.

induction 전과 후의 OD를 측정해보시면 다른 것을 확인할 수 있습니다.

OD 측정하셔서 동일한 양을 loading하셔야 질문자께서 원하는 비교를 할 수 있습니다.

induction 전에는 cell 양이 적어서 SDS-PAGE로 충분히 확인될 정도가 아니기 때문에 위와 같은 결과가 나옵니다.

non-induction sample을 더 낮은 볼륨으로 lysis 시키거나, induction시키는 샘플과 동일한 시간을 배양한 후에 harvest하여 lysis하면 원하는 결과를 얻을 수 있습니다.

결론적으로 위의 결과는 cell 양이 충분하지 않아서 단백질이 잘 보이지 않는 것이지 없는 것이 아닙니다.

대왕개구리SPEED  |  11.21 13:41  

- 접종 할 때의 균체량은 문제가 아니고 loading 할 때의 단백질 양이 낮아서

안보일 뿐입니다.

 

- 단백질 양이 적은 이유는 lysis 시 균체양이 적었던지 lysis 효율이 낮았던지

여러 원인인 있을 수 있습니다.

 

- loading 할 때 단백질 정량 또는 A280에 측정을 해서 비슷 한 양을

loading하면 단백질 양이 특별히 적어지는 현상을 방지 할 수 있습니다.

알대학생입니당  |  11.21 21:46  

답변 주셔서 감사합니다.제가 부족해서 답변이 다 이해가 가지는 않았지만.. induction 전 sampling은 OD값이 0.5와 0.6에 도달하는 것을 확인하고 sampling하였는데도 해당이 되나요?

대왕개구리SPEED  |  11.22 09:39  

균체 OD하고는 관계없고 lysis 후 단백질 양이 전기영동과 직접적인 관계가

 

있습니다.

 

균체가 일정하면 단백질 양도 일정하게 나오지만 lysis 효율이 안좋은 경우는

 

단백질 양이 적게 나오므로 항상 전기영동 전에 단백질 양을 확인하는 것이

 

좋습니다.

 

각 lane 별로 단백질 양을 측정했나요?

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