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질문 DNase 활성 및 이용가능 buffer 문의
알돈먹는꼬마(대학원생)  | 2021.11.13 22:18

안녕하세요. 이번에 biotinyltaed DNA (vector/ pcr product)를 이용해 biotinylated DNA를 streptavidin으로 pull-down 후 해당 dna에 binding한 protein을 Western blot으로 검증하는 실험을 수행중에 있습니다.

https://academic.oup.com/nar/article/47/19/10235/5565289

위 링크 논문의 method를 참고하여 진행하고 있는데 sample boiling 직전에 DNase를 처리하는 step이 존재합니다.

 

그런데 DNase를 어떤 buffer 조성에서 처리를 하여야할지 모르겠어서 질문을 드립니다.

 

NP40또는 RIPA 등의 elution buffer에서 DNase 이용이 가능한지 혹은 DW나 다른 버퍼에서 dnase 처리 후 sample buffer로 boiling해야할지 의견이 궁금합니다.

 

감사합니다.

#IP
 
#ChIP
 
#pull-down
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리레몬민트  |  2021.11.14   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

논문 method를 보면 kit를 썼다고 나옵니다.
(Ambion DNA-free Kit, Foster City, CA, USA)

키트 매뉴얼을 보면 10x DNase I buffer를 사용한다고 나오는 것을 보니 키트에 버퍼가 포함되어있는 것 같습니다.

그리고 NP40과 RIPA buffer는 cell lysis 때 사용하는 버퍼인데, elution buffer로 사용하는지는 모르겠지만, cell lysis 때 DNase 이용은 protein purification 분야에서는 흔히 사용하는 방법입니다.

DNase는 DNA를 제거하기 위한 목적이니 언제든 DNA 제거가 필요한 시점에 사용하시면 됩니다.

대왕개구리SPEED  |  2021.11.14   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- sample boiling 직전에 DNase를 처리하는 step이 존재합니다.

: boiling 직전이 아니라 slot blot 할 시료를 bead에서 분리하기 위해

DNase를 처리합니다.

slot blot은 시료를 boiling하지 않아도 됩니다.

WB는 통상의 방법으로 진행하면 되고 boiling 직전이 아니라 bead에서

단백질을 elution하는 단계로 보면 됩니다.

 

- DNase를 어떤 buffer 조성에서 처리를 하여야할지 모르겠어서

: kit에 buffef가 들어있습니다.

 

- NP40또는 RIPA 등의 elution buffer에서 

: elution에 사용하지 않는 buffer인데 어떤 목적의 elution buffer인가요?

 

 

- DW나 다른 버퍼에서 dnase 처리 후 sample buffer로 boiling해야할지 

: DNase는 lysis buffer에서도 바로 처리가능하고 논문의 실험에서는 kit에

포함된 buffer를 사용하면 됩니다.

elution된 단백질은 sample buffer와 혼합해서 WB에 사용하면 됩니다.

알돈먹는꼬마  |  2021.11.14   

먼저 두분 답변에 진심으로 감사드립니다.

Elution은 제가 인터넷을 검색해보니 cell lysis buffer가 들어있는 cell lysate에 DNase를 처리하여도 활성에 크게 문제가 없다고 하여 elution buffer로 고려했습니다. 제가 갖고있는 kit상의 Elution buffer는 바이오니아 MagListo™ Protein G Kit의 제품 안에 들어있는 elution buffer로 low pH의 glycine buffer입니다. 

boiling step은 제가 말씀을 잘못 드렸는데, Dnase처리와 elution을 별개의 step이라고 생각을하여 WB 실험상에서는 sample buffer를 넣고 boiling하기 전으로 표기를 했는데 말씀하신 것처럼 elution step이 정확한 것 같습니다.

키트에 있는 10x buffer와 DNase를 처리하는 step 직전에 bead를 TBST, eltuion buffer 또는 washing buffer 중 어느 버퍼에 resuspension 해야할 지 몰라 질문을 드리게 되었습니다. DNase의 활성이 salt나 다른 물질(EDTA같은 chelator)에 저해된다고 알고 있어서요. 또한, low pH의 elution buffer에 의한 저해도 있을 지 모르겠습니다.

다시 질문을 드리자면, pull-down과 wash를 마친 상태에서 DNase를 처리할 때 sample은 어떤 솔루션에 resuspension을 해놓고 10x buffer와 DNase를 처리하는게 좋을지 의견 부탁드립니다.

그리고, 저도 본문 링크 논문과 비슷하게 biotinylation 된 pcr product로 transfection을 하여 cell lysis를 진행합니다. 이때 RIPA buffer를 쓸 경우 centrifugation을 하여 하단에 젤리같이 뭉치는 chromatin을 제거할 필요 없이 resuspension하여 이후 실험을 진행해도 문제가 없을까요?

감사합니다.

 

 

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