실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
His tag 단백질 침전
레벨1 찰꽈 (대학생)
His tag 단백질을 정제 중에 있는데 침전이 생겨 처음보는 현상이라 교수님, 박사님 정제 버퍼를 바꿔보라는 말 이외에는 아무 조언안해주셔서 원인을 알고 싶어 글씁니다ㅠㅠ
해당 단백질은 inclusion bodies를 refolding해야하는 단백질인데 His tag가 없었을 당시에는 SP column으로 해당 단백질 이외에 다른 단백질이 많이 정제되었고 발현율도 낮아서 어쩔 수 없이 His tag를 붙이게 되었습니다.
문제는 이때부터입니다.
His tag 단백질이니 니켈컬럼으로 정제를 하는데 정제되자마자 반정도가 침전이 있습니다. 하지만 침전이 있다는 것조차 모르게 elution 자체는 너무 투명합니다. 어느 컬럼으로 정제해도 elution에는 너무 투명하고 그 전단계인 refolding에서도 SDS-PAGE에서 전체적으로 반정도는 Pellet인데 해당 샘플은 너무 투명하고 TCA down에서도 침전된게 안보이네요.
SDS-PAGE 내리고 나서야 확인할 수 있습니다. 그럼 Pellet을 제거해주면 되지 않냐 하시면 원심분리나 필터로 제거해도 다음날이면 또 반정도 침전되어있고 그 샘플역시 투명합니다.
해당 관련 논문 어떻게 찾아야할지 막막하고... 정제 버퍼를 바꾼다한들 침전에 안갈지 또 누가 알겠습니까... tag 때문에 침전가는 경우는 있지만 투명하면 이 또한 계속 SDS-PAGE 확인전까지 다음단계 진행못하고 His tag를 떼어낼려면 enzyme을 사야하는데 클로닝 해주신 분의 파일을 보니 thrombin으로 뗄수는 있지만 테스트 하기엔 형편이 좀 안좋네요ㅠㅠ
조언좀 구합니다ㅠㅠ
refolding 방법이 잘못된건지 다른 논문 참고해서 정제 버퍼도 기존에 사용하는 방법 안쓰고 했는데도 그것조차도 elution에서 투명하나 반정도는 pellet 침전하였습니다. 침전을 제거한다 한들 dialysis 과정도 해줘야하고 동결건조 후에는 다시 녹일때 침전이 없어야하는데 계속 침전이 생겨서 결국은 단백질이 없더라구요...ㅠ 오히려 정제 못한다고 교수님이 탓하셔서 조언구합니다
원인을 알아야 thrombin을 어떻게든 사던가 뭘 할 수가 있어서 침전이 투명하게 되는 이유 조언좀 구합니다ㅠㅠ
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