실험Q&A를 통해 여러분의 지식을 나누어 주세요. 답변을 등록하시려면 로그인 해주세요.
본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
- DNA/RNA prep을 진행하고 있는데 PCR 후 밴드가 뜨지않아 확인해보니
핵산이 뽑히지 않고 있었습니다
: 추출 후 확인을 하고 PCR을 하는 것이 정상적인 순서입니다.
- 스텝을 나눠서 진행한 후 나노드랍을 찍어보았는데
1.lysis buffer 처리후 elution
2. washing A 처리후 elution
3. washing B 처리후 elution
: 크게 의미있는 과정은 아니라고 보이며 정상적인 추출 방법을 했을 때
어떻게 나오나요?
예전에는 동일 kit를 사용했을 때 추출이 잘 되었나요?
-
레벨2
Vind
(일반인)
-
21.08.26 14:33
- 확인 후 PCR에 들어가는것이 맞으나 초기에 확인후 진행하다가 계속 밴드도 잘떠서 확인과정 스킵한 후 진행하고 있었습니다ㅠ
- 정상적인 추출방법으로 추출했을때 washing B buffer 처리했을때랑 동일하게 결과값이 나오고 핵산 농도가 잡히지 않아서 세가지 스텝으로 나눠서 진행한 후에 찍어보았습니다.
- 이전에도 같은 키트로 사용했을때 잘 추출되었습니다.
실험실에 다른 회사 prep 키트도 있어서 비교해보았는데 같은 문제가 발생하는데 뭐가 문제인걸까요 ㅠㅠㅠㅠ?
-
레벨2
Vind
(일반인)
-
21.08.26 16:52
이 제품 사용하고있습니다!
-
ara18
(비회원)
-
21.08.26 17:58
핵산 뽑아서 pcr 할 때 워싱은 크게 상관 없는 것 같고요
중요한게 애초에 lysis랑 끝에 elution 할때가 문제 생기는데
처음에 시료양이 너무 적어서 라이시스를 해도 적당한 양의 핵산이 추출이 안되었거나 라이시스 시간이 너무 부족하면 뒤에는 아무리해도 말짱 꽝이고요
일루션버퍼를 써서 핵산 녹여내야하는데 제대로 못 녹여내면 핵산을 못 얻죠
마지막 일루션을 2~3회 반복해보세요 그래도 안나온다면 첫번째 스텝인 라이시스가 문제입니다.
일단 기존 핵산 추출방법을 구체적으로 알아야 트러블슈팅이 가능할거같네요.
시약만을 사용했다면 어느 브랜드의 어떤시약의 프로토콜로 했는지,
Column 키트로 했다면 어느브랜드의 카다로그 넘버 어떤 제품으로 했는지. 먼저 확인을 해야 할 것 같고,
DNA추출과정에서 보통 핵산이 잘 안뽑히는 경우는 Lysis step에서 제대로 안되었을때 그런 경우가 많습니다. 특히 터프한 샘플의 경우 Bead beater같은 homogenizer로 완전히 Lysis한 후 실험을 진행해야 하는 경우도 많습니다.
이런부분을 체크 해보세요.
-
레벨2
Vind
(일반인)
-
21.08.30 18:13
답변 감사합니다.
샘플은 혈액 spin down 해서 혈청만 사용하고 있습니다.
lysis step이 있는 kit 뿐만 아니라 DNA purification이나 Plasmid prep kit도 PW처리하면 농도가 찍히지 않아서 EtOH 첨가해서 사용하는 washing buffer가 문제라고 생각했습니다.