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CRISPR knockout 꿀팁? 아이디어 가르쳐주새요
레벨2 GATA3 (과기인)
안녕하세요, 분자생물쪽 전공과 거리가 멀지만 프로젝트 필요에 의해 gene editing쪽을 해보고 있는 크린이입니다.
저는 주로 KI은 ZFN vector를 사용하여 Nucleofection 하고, 형광이나 surface molecule이라 flow sorting 해서 문제가 없습니다만,
지금은 KO target gene이 nucleus protein이라 일일이 single cell cloning 하고 T7EI assay 하고 Sanger seq 하는 이 모든 과정이 넘나 벅찹니다. 특히 일부 line은 iPSC 라서, single cell cloning 과정만으로도 문제가 많이 생기기도 해서요…
그래서, 최근 몇가지 고민을 해봤는데, 이런 아이디어들이 생각이 났구요, 일부는 아마 루틴하게 쓰시는 분들도 있을 것 같아서 꿀팁 부탁드립니다.
1) KO site에 HDR template로 neoR 등을 KI한 후 selection 한다
2) KO site에 HDR template로 GFP등을 KI한 후 flow sorting 한다
: 1이나 2를 쓰면, exon을 끊어먹고 KI이 되는지라 target gene KO과 donor template KI이 동시에 일어나니 selection이 쉬울 것 같구요
3) KO site에 HDR template로 stop codon을 마구 넣어버린다
: 이건 selection 자체에는 도움이 안되겠지만 indel 자체를 통한 KO 보다는 나을 것 같고…
혹시 꿀팁 있으시면 공유해주시면 감사하겠습니다. Nucleofector는 Lonza machine을 쓰고 있고, RNP를 이용하고, 제품들은 IDT 것들을 쓰고 있습니다 (클로닝은 잘 합니다만 lenti등은 가능하면 안쓰고 있습니다).
미리 감사드립니다!
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