안녕하세요! 석사 1차를 fractionation으로 보낸 대학원생입니다,,,

세포질과 핵막 분리 버퍼를 직접 만들어 사용하는 중인데요 두 단백질 분리가 잘 안됩니다ㅠㅠ여러 논문과 브릭을 참고하여 buffer를 새로 만들고 프로토콜도 수정해보았는데 문득 NP-40때문에 핵막이 깨지는건 아닌가 의문이 듭니다.

우선 버퍼의 조성은 아래와 같습니다.

buffer A

10mM HEPES (pH 7.9)

10mM KCl

1.5mM MgCl2

0.1mM EDTA

1mM DTT

0.5mM PMSF (in isopropanol)

0.5% TritonX-100

0.5% NP-40

buffer B

20mM HEPES (pH 7.9)

0.4M NaCl

1.5mM MgCl2

1mM EDTA

1mM DTT

1mM PMSF (in isopropanol)

10% glycerol

과정은 간단하게 설명하자면 buffer A를 넣고 ice에서 20분 뒤 14000rpm에서 5분, buffer B를 넣고 ice에서 40분(10분마다 vortexing) 뒤 16000rpm에서 10분 입니다.

NP-40은 핵막을 깰 수 없을정도로 약한 detergent라고 알고있습니다. 근데 여기서 buffer A를 넣고 너무 오래 놔두어서 핵막까지 깨지는것일까요?? NP-40의 농도가 높거나 반응 시간을 높히면 핵막까지 깨질 수 있나요?

아래 사진은 부끄러운 제 western 결과 입니다,,,cytoplams에서 Histone이 많이 검출되는걸 보여드리려고 첨부합니다ㅠㅠ