1. 이 경우 아래 첨부된 사진의 mRNA 서열 1부터 1897까지 모두 긁으면 되는 것 맞나요? 그럼 5'UTR과 CDS, 3'UTR 모두 포함되는 것일까요?
--> 어떤 방식으로 합성하는지 여부에 따라서 일단 다르겠지만, 회사에 합성을 요청하는 방식이라면 일반적으론 Start codon 부터 Stop codon까지만 제공하면 될 것으로 보입니다. (다만, 어떤 종에서 발현할지 여부는 알려줘야 그에 걸맞는 5', 3'UTR 서열을 붙여줄 수 있을것 같습니다. 이 부분은 주문 요청하시는 회사랑 잘 합의를 보셔야 할 부분인 것 같네요)
2. 저는 소 (bovine) 세포에 transfection 할건데, GFP 서열은 어떻게 찾아야할까요..?
NCBI 찾아보면 Synthetic construct EGFP (EGFP) gene, complete cds
랑 mouse eGFP mRNA가 있는던데.. synthetic construct eGFP 서열을 적용하면 되는걸까요??
--> 일반적으로 mammalian이면 EGFP면 충분히 발현 잘 되는 것 같은데, 보통 내가 발현시키고자 하는 종에 맞춰서 codon-optimization을 시킨다고 보시면 될 것 같습니다. (일반적인 EGFP 염기서열은 구글링만 해도 나오고, 잘 찾아보시면 bovine optimized EGFP도 있을 것으로 보입니다.)
3. 하나의 mRNA에 GFP tagging, target gene을 넣으려면 순서를 어떻게 연결 해야할지...
Target gene mRNA 서열 (5'UTR,CDS,3'UTR) - GFP mRNA 서열 (5'UTR,CDS,3'UTR)
이렇게 붙이면 되는 것일까요?? 아니면
Target gene의 5'UTR- target gene의 CDS, GFP의 CDS - target gene의 3'UTR
이런식으로 연결을 해야하는 것일까요?ㅠㅠ 이럼 target gene만 번역되고 끝날 것 같은데..
--> Fusion protein을 제작할 때는 어떤 목적을 가지고 하는지에 따라서 다양한 방식으로 제작이 가능한데... 단순히 efficiency 확인을 목적으로 하신다면 원하시는 target gene과 묶여있지 않는 편이 나을 것으로 보입니다.
가장 흔하게 사용하는 방식을 추천드리자면...
1) Target gene (without stop codon) + Protein linker (다양한 형태가 존재합니다만... 전 주로 GGGGSGGGGS 같은 GS linker를 즐겨 사용합니다.) + EGFP (with stop codon)
--> 보통 fusion할 때 target gene의 C-term에 많이 붙이는데 N-term보다 발현 효율이 좋았던 것으로 기억합니다. 하나의 protein으로 형성이 되서 원하시는 target gene의 localization까지도 확인할 수 있으실 겁니다. 다만, EGFP가 fusion 되면서 target gene의 function을 방해할 수 있습니다. Amino acid 서열이 길어짐에 따라 translation 효율이 떨어질 수 있습니다.
2) Target gene (without stop codon) + E3A/P2A/T2A (Auto-cleavage linker) + EGFP (with stop codon)
--> EGFP와 Target gene이 같은 하나의 단백질로 발현된 뒤, auto-cleavage되어 두개의 단백질로 나눠지도록 디자인된 형태입니다. 이 경우, 각각 떨어져서 존재하기 때문에 function에 방해를 주지 않지만, target gene의 stability, localization 등의 추적이 어렵습니다.
3) Target gene (with stop codon) + IRES + EGFP (with stop codon)
--> EGFP와 Target gene이 각각 다른 ribosome binding site로부터 translation이 되기 때문에 발현 효율은 좋지만, mRNA 서열의 길이가 길어지는 단점이 있습니다. (이 경우, 견적가가 올라가겠죠.) 그리고, IRES가 bovine에서도 작용하는지는 정확히 잘 몰라서 이 부분도 확인해볼 필요가 있을 것으로 보입니다. (대개 mammalian에서는 다 작동할 것 같지만..)
이외에도 좋은 방식들 많이 있을 수 있지만, 제가 일단 생각나는 방식은 위와 같네요. 여기서 한가지 타입 고르시고 그 다음에 1번 사항에서 말씀드렸던 것처럼 회사 측과 상의해서 5', 3' UTR 붙이시면 될 것 같네요.