- protein loss가 생각보다 많이 생겨서..
: 몇 % 정도 loss가 생겼고 loss는 어떻게 측정했나요?
사용한 filter size는 micro size인가요?
몇 rpm에서 실험 했나요?
참고로 90Kda를 30kda로 c/o하면 수율은 95% 나옵니다.
-
레벨5
SCIENTIST00
-
21.05.26 19:06
1. loss가 생긴 것은 어떤게 알게됐나요?
sds-page를 해봤는지, 혹은 남아있는 protein solution의 농도를 측정해서 알게됐는지.
2. 경험상 30-40%의 손실은 발생하더군요. 10mg에서 농축을 시작했을때, 최종적으로 얻게 되는 양이 6-7mg이었습니다.
3. protein에 비해 많은 buffer를 넣었다는 의미는 시작 농도가 매우 낮다는 것으로 생각됩니다. 그럼 필터에서 빠지는 buffer 양이 매우 많게 될 것입니다. 이것은 loss와는 관련없습니다. 농축을 시작할때 protein의 농도는 loss와 상관없습니다.
4. centrifuge중간에 pipetting을 해주는 것은 필터 아래쪽으로 단백질 분자가 모여 농도 불균형이 생기기 때문입니다. pipetting 없이 계속 돌리게 되면 아래쪽에서 침전이 생길 수 있습니다.
5. amicon 필터가 손상됐을때 loss가 심할 수 있습니다. 만약 amicon필터를 반복 사용한다면 발생할 수 있는 문제입니다.
6. centrifuge의 속도가 너무 빠를때 loss가 심할 수 있습니다. 메뉴얼에 나온 최대 속도는 4000g 입니다. 반드시 그 이하로 돌려야 합니다.
7. 마지막 가능성은 농축 중에 침전이 생겼지만 육안으로 확인되지 않는 경우입니다. 침전이 되거나 aggregate를 형성하게 되는 경우에 centrifuge 후에 버퍼가 빠지는 양이 급격하게 줄게 됩니다. 매번 돌릴때마다 빠져나온 부피를 유심히 관찰해야 합니다.
-
레벨1
sunoi
(대학원생)
-
21.05.26 19:19
Protein loss는 nanodrop을 사용해 처음 protein absorbance와 centrifuge한 뒤 absorbance를 측정한 뒤 계산해서 concentration을 구했고 또 mole로 바꿔서 비교해봤습니다. 계산 결과 2-3배 정도 낮게 나와 저가 하는 방법이 맞는지 의구심이 계속 들었습니다.
사용한 filter size는 30K cutoff amicon, volume unit은 µL입니다!
Protein을 1200rcf에서 돌렸습니다.
같은 실험실 동료가 buffer를 protein volume에 맞게 넣어야 loss가 잘 안생긴다고 해서 (부교수님은 이런 얘기 안해주셨습니다..) 이해가 가지 않아서 몇 번 더 물어봤는데 너무 헷갈려서 혹시 buffer 넣는 ratio가 따로 있는 건지 여쭈어 보려고 글을 올렸습니다!
- nanodrop을 사용해 처음 protein absorbance와 centrifuge한 뒤
absorbance를 측정한 뒤 계산해서
: 필터 사용 전 후 단백질 농도는 부피 보정을 해서 계산했나요?
필터 불량아니면 농축 실험을 잘못해서 loss가 발생한 것 같습니다.
UF 농축 표준 방법으로 실험을 해보세요.
-
레벨1
sunoi
(대학원생)
-
21.05.26 19:29
필터 사용 전 후 단백질 농도는 부피 보정을 해서 계산했나요?:
네! 필터 사용 전과 후 부피 보정하고 계산한 뒤 mole값을 얻었어요.
UF 농축 표준 방법도 한번 찾아보겠습니다! 도움주셔서 감사합니다!
mole 농도를 구한다면 100% 정제된 단백질인가요?
ug/ml로 시료를 관리하는 것이 농축도 조절에 편리합니다.
-
레벨1
sunoi
(대학원생)
-
21.05.27 20:34
답변 주셔서 너무 감사해요!!
다시 한번 실험해보니 단백질 loss가 많이 안나서 이대로 진행하기로 했어요.
도움 주셔서 정말 감사합니다!