실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Extraction/Isolation
BCA 정량 시 뿌옇게 변하는 현상에 대해
레벨1 nomask (대학원생)
안녕하세요.
문제 해결이 아직 어려운 석사생입니다.
RIPA buffer를 가지고 cell line을 lysis 하는 과정에서 문제가 있는데, 해결이 되지 않아 질문드립니다.
첨부한 사진을 참고하셔서 어느 부분이 문제가 될 수 있는지 조언주시면 큰 도움이 될 것 같습니다.
lysis protocol은
먼저 cold PBS wash,
scraper로 harvest,
RIPA buffer(+protease inhibitor) suspension 후 vortex,
(10 min incubation on ice)
sonication,
(20 min incubation on ice)
13000rpm 30min centri
의 과정을 거쳐 lysate를 얻었습니다.
이후 정량을 위해 lysate를 96-well 에서 BCA와 섞어주면 첨부한 사진과 같이 뿌옇게 변해버립니다.
사진에서 가장 왼쪽의 맑은 well은 RIPA와 다른 조성으로 만든 lysis buffer를 사용한 sample 인데 큰 문제 없고,
시판중인 RIPA를 사용한 두 번째, 세 번째 well 에서 뿌옇게 변하는 현상이 발생합니다.
아랫줄의 well은 RIPA를 50% 더 많이 넣어준 lysate인데 마찬가지로 탁한 것으로 보아 RIPA의 부족으로 lysis 가 덜 된 것은 아니라고 생각합니다.
protein외에 lipid 같은 것들에 의해 lysate가 뿌옇게 보이는 경우가 있는 것 같습니다. 제 경험으로도 다른 cell 에서 lysate의 상층액에 구름같이 흰 띠가 보이는 경우가 있었는데, 이 cell에서는 그런 층이 보이지 않고, 표면상으로는 별다른 점이 없다가 BCA와 만나는 순간 변해버립니다.
평소에는 RIPA가 아닌 다른 buffer를 사용하지만 RIPA도 정상적으로 사용해 보고자 하는 마음에 문제점을 찾고 있습니다.
혹시 이런 경험을 해보셨거나, 의심가는 부분이 있으신 선생님들이 계시면 조언 부탁드립니다.
감사합니다.
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