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[Western실험시 lysis 버퍼 조성 질문 드립니다] RIPA 버퍼와 Protease inhibitor
레벨2 크리스12 (대학원생)
안녕하세요? 석사 1기 학생입니다.
저희 방에서 western blot 실험을 거의 하지 않는데,
제가 맡게 된 프로젝트에서 western blot을 많이 하게 되어
이번에 저희 방에 세팅을 다시 하게 된 상황입니다.
cytosol에 존재하는 protein을 extract할 계획인데요,
논문들을 찾아보니 RIPA buffer와 protease inhibitor cocktail을 섞어서 사용하더라구요. 그래서 sigma-aldrich사에서 RIPA buffer와 Protease inhibitor cocktail 을 구매했습니다. 그런데 RIPA buffer와 Protease inhibitor cocktail을 어느 비율로 섞어서 사용해야 하는지 궁금합니다.
사이트에서 제공하는 매뉴얼은 아래와 같습니다.
* 1 mL of the RIPA Buffer is used to lyse cells from one 100 mm culture dish (0.5~5*107 cells) of most adherent mammalian cell lines.
--> 100mm culture dish에 BHK cell을 배양해서 떼어내면 총 1ml의 RIPA buffer를 사용해서 깨면 된다고 하네요..!
* 1 mL of Protease inhibitor cocktail solution is recommended for the inhibition of endogenous enzymes found in 100 mL of lysate from 20 g of bovine liver or 10 mL of lysate from CHO cells. This product is supplied as a solution in DMSO.
--> 제가 사용하는 cell은 CHO 가 아니고 BHK인데.. 상관 없는 건가요?? CHO는 그냥 대표적인 예로 제시하는 것인가요?
또 10ml 의 cell lysate에 1ml의 protease inhibitor cocktail이 필요하다는 건..
9ml cell lysate + 1ml protease inhibitor cocktail 이렇게 10X로 사용하라는 게 아니고
10ml cell lysate + 1ml protease inhibitor cocktail 이렇게 11X (굳이 따지자면..)로 사용하라는 건가요?
그리고,, 'lysate'라는 표현을 사용하는 것을 보면 RIPA buffer 만으로 cell을 먼저 깨뜨리고 나서 그 후에 protease inhibitor cocktail을 처리하라는 것 같은데.. 논문에서 보면 분명히 '섞어서' 사용하는 경우가 많았거든요..
요약하면,, 100mm culture dish에 키운 mammalian cell을 샘플링하려면
1㎖ (밀리리터)의 RIPA buffer 와 100㎕(마이크로리터 or 람다)의 protease inhibitor를 섞어서 사용하면 되는 것인가요?
답변 주시면 큰 힘이 될 것입니다..
고견 부탁드리겠습니다. 미리 감사드립니다!
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