실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
Lentiviral vector 클로닝
레벨2 잠시만... (과기인)
제가 Lentiviral 벡터를 클로닝 중인데, 클로닝이 너무 안되어서 질문 드립니다.
실험실에 가지고 있는 pLenti-vector를 이용하여 클로닝 중인데요.
insert로 넣을 단편은 PCR로 증폭이 잘 되지 않아, 업체에 의뢰해서 gene 합성을 하였습니다. (벡터에 포함된 상태로 수령)
합성되어온 insert는 제한효소로 잘라서 gel extraction하여 정제하였습니다.
pLenti-vector 역시 동일한 제한효소로 잘라서 gel extraction 후 정제하였습니다.
정제 후 insert(950 bp), vector(7.5kb) 모두 전기영동하여 순도확인하였고, 클로닝 진행하였습니다.
competent cell은 NEB stable을 사영하였고, transformation 후 콜로니가 30개 정도 떴습니다.
그 중 콜로니 19개를 따서 colony PCR을 수행하니 증폭되는 밴드가 약하기는 하지만, 모든 콜로니에서 타겟 사이즈에 밴드가 증폭되는 것을 확인하였습니다.
이때 까지만 해도 수월하게 진행될 줄 알았는데...ㅠㅠ
그 중 콜로니 4개를 따서 mini prep해서 제한효소로 잘라보니
타겟 사이즈로 잘리는 게 하나도 없습니다.
상대적으로 크기가 작아 잘리는 양이 적을 수도 있을 것 같아
양을 많이 잘라서 로딩해서 확인해 봐도 동일하네요.
control에서는 잘리는 밴드가 확인이 되구요.
mini prep한 plasmid로 PCR 해 보면 증폭되는 양이 적긴 하지만 타겟사이즈 밴드가 보이기는 합니다. 물론 다른 밴드도 같이 증폭되기는 하지만...
몇 번을 다시 클로닝을 해도 동일한 양상으로 나타나는데 이럴 경우 어떻게 해야 될까요? 거의 3달째 이러고 있으니까 답답하네요.
그냥 업체에 클로닝 서비스 맡길까 생각도 들구요.
이런 경우는 어떤 부분을 확인해 봐야 될까요?
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