primer를 디자인 하는 이유가 1종의 primer로 14종을 동시에 증폭하는 건가요
아니면 primer로 14종을 구분하는 건가요?
최소 18mer 정도 primer를 만들 정도의 공통 서열은 안보입니다.
그 universal 부분을 universal site라고 합니다. 이게 PCR 프라이머의 성립조건과 맞아야 프라이머를 둘 수 있습니다. 예를 들면 3' 말단 안정성이 충분히 높을 정도로 연속적인 염기서열이 보존되어 있어야 한다던가.
경우에 따라 어떤 분류군에 통용할 수 있는 프라이머나 마커를 개발하는 게 쉽지 않습니다. 이때는 대상 분류군을 좁혀서 그룹을 나누고, 그룹단위로 프라이머/마커를 설계하는 것이 좋습니다. 여기서는, 언듯 보기에, 종간 서열의 다형성이 커서 PCR 프라이머를 짤만큼 잘 보존된 서열 부위가 없어 보입니다. 특히 가장 위와 가장 밑의 서열은 다른 것과 큰 차이가 있어서 계통적으로 완전히 다른 듯 합니다. 대상이 되는 종이 이 두종과 거리가 있다면, 이 차이가 나는 종은 제외시켜야 하겠죠. 즉, 가능하면 근연종의 범위를 더 좁혀서 정렬을 해야 할 듯 합니다. 그 범위를 정하는 근거가 될 종의 분자계통에 대한 정보가 부족하다면, 여러 염기를 섞어쓰는 degenerate primer로 설계를 하는 것도 가능합니다(하지만, 성공 가능성이 낮다는 것 염두).
마지막으로, 이런 목적의 공통 프라이머 설계 프로그램이 많이 있습니다. "group-specific primer", "universal primer", "pcr primers on aligned sequences" 등을 키워드로 구글해보세요.
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레벨2
하이하리
(대학원생)
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21.04.17 16:37
primer를 디자인 하는 이유는 다른 종에 있는 AChE 부분을 확인하고자 합니다.
제가 가지고 있는 종은 모두 Tabanidae과인데, 이는 tabanomorpha<Brachycera에 속하며, 첨부드린 14개의 종은 모두 Brachycera에 속합니다. tabanidae과나 tabanomorpha의 AChE 서열은 NCBI에서 찾을 수 없어 가장 유사한 종인 Hermetia(가장 윗서열)를 기준으로 프라이머를 제작하려고 합니다.
이제껏 프라이머3, NCBI primer blast를 통해서 프라이머를 제작했으나, 모두 tabanidae과에 있는 서열이 있었기에 프로그램을 돌리는 것이 가능했지만, 이번에 하는 실험은 정보가 너무 없어 어떻게 해야 할 지 모르겠습니다.
universal site 마다 모두 프라이머를 짜서 포인트끼리 맞춰보고 프로그램을 돌리라고 이야기 들었는데, 계속 검색해봐도 방법을 모르겠습니다.
suborder 수준에서 서열 수집 정리가 된 상황인건가요? 근연종 AchE 서열정보가 부족하기 때문에 universal site를 추론하기 어려운 상황이네요.
1) 어쩔 수 없으니, 14종 서열을 단백질 수준에서 정렬하고, 서열보존도가 높은 지역을 찾아 degenerate primer를 짜던가,
2) 해당 분류군을 속이나 과 수준에서 몇개 cDNA 클로닝을 해서 서열을 확보한 후, 다시 정렬하고, 보존된 지역의 프라이머를 짜던가,
3) 기존 출판된 프라이머가 있으면(적어도 Dipteria 수준의 phylogeny 프라이머는 나와 있을 겁니다), 그걸 이용하던가,
여러가지 방법을 생각해 보세요.
그런데, 제가 Herimitia의 유전자의 모델을 찾아보니, 간단한 구조가 아닌 걸 봤습니다. 지금 정렬한 서열은 transcript인데, PCR을 genomic DNA로 한다면 결과가 예상과 많이 달라집니다. 프라이머 설계할 때, 이 구조도 같이 검토해야 합니다. 엑손을 멀리 떨어뜨리면 안되니까요.
오늘은 한가해서 질문 내용을 약간 조사해 봤습니다.
blast 결과를 계통분류해보니 유전자 그룹이 2개로 나뉘고, 그 모델이 완전히 다른 것을 봤습니다. 재수없게 이 유전자는 그 영역의 크기가 200kb가 넘는 어마어마한 덩치입니다. 프라이머 짜기에 제한이 많겠습니다.
NCBI NR blast에서 걸린 서열들의 단백질 아미노산 서열을 정렬하고, 계통으로 묶어보면 Hermetia에 가까운 그룹은 49개의 서열이 있고, 이들을 따로 정렬하고, 보존된 블럭을 찾아서 대략 표시해봅니다. block1~block5까지 회색 도형 부분입니다.
다음으로, CDS 서열에서 위의 단백질 보존서열 영역에 해당하는 염기서열을 분홍색으로 표시했습니다. 가장 위 1번 서열이 Hermetia 것이고, 거기에 불일치하는 염기를 하이라이트시켰습니다. 초록색과 연두색은 Huchard et al. (2006)에서 제시된 degenerate primer의 위치입니다. 제가 잡은 보존서열영역에 자리잡은 것을 볼 수 있는데, 저들이 나름 고민을 했다는 거겠죠.
프라이머 위치를 확대해보면,
아주 좋은 건 아니지만 조건잡기에 따라 PCR은 그럭저럭 나올 수 있는 정도로 생각됩니다.
degenerate primer로 pcr 예측해본 결과:
_______________________________
In silico Primer(s) search for:
ace2dir4 5'-aaygcnccstggagycayatgac
Position: 75524->75546 23bp 78% Tm = 43.3?C
5-aaygcnccstggagycayatgac->
|| || || ||||| || |||||
acttacgagggacctcggtgtactggccg
ace2rev6 5'-ccvgartasgarttccaytgytg
Position: 75924<-75946 23bp 74% Tm = 33.3?C
<-gtygtyaccttragsatragvcc-5
|| || ||||| || || || ||
ttcaacaatggaattcgtattcaggcatt
ace2dir3 5'-tggatytayggbggyggsttyatg
Position: 75161->75184 24bp 75% Tm = 36.5?C
5-tggatytayggbggyggsttyatg->
||||| || || || || || |||
aaacctagataccacctcctaagtactcac
ace2rev3 5'-gtcatrtgrctccasggngcrtt
Position: 75524<-75546 23bp 78% Tm = 41.8?C
<-ttrcgnggsacctcrgtrtactg-5
|| || || ||||| || |||||
tgaatgctccctggagccacatgaccggc
ace2dir4 5'-aaygcnccstggagycayatgac
ace2rev6 5'-ccvgartasgarttccaytgytg
PCR product size: 423bp
ace2rev6 5'-ccvgartasgarttccaytgytg
ace2dir3 5'-tggatytayggbggyggsttyatg
PCR product size: 786bp
ace2dir3 5'-tggatytayggbggyggsttyatg
ace2rev3 5'-gtcatrtgrctccasggngcrtt
PCR product size: 386bp
--> 개선의 여지가 있죠. 실력 발휘를 해 보세요.
그런데, 중요한 건 genomic DNA를 대상으로 하기 때문에 유전자 모델을 보면서 디자인하고 예측해야 한다는 점입니다.
기존 연구가 이미 존재하기 때문에, 그 정보를 비교삼기 위해서라도 해당 부분 exon3, 4를 표적으로 짜야할 필요가 있어 보입니다.
참고문헌입니다.
Huchard E, Martinez M, Alout H, Douzery EJ, Lutfalla G, Berthomieu A, Berticat C, Raymond M, Weill M. Acetylcholinesterase genes within the Diptera: takeover and loss in true flies. Proc Biol Sci. 2006 Oct 22;273(1601):2595-604. doi: 10.1098/rspb.2006.3621. PMID: 17002944; PMCID: PMC1635460.