sample의 전기영동이 잘 안된것 같습니다.
zymography한 시료를 각각 2개 만들어 하나는 SDS-PAGE, 하나는 zymography를
하여 활성 보다 전기영동이 정상적으로 되는지 확인해 보세요.
sample buffer 조성과 sample은 어떻게 준비했나요?
-
레벨1
팬더판
(대학생)
-
21.04.12 10:48
sample buffer는 제가 만든게 아니라 정확한 조성은 모르지만 일반적으로 쓰이는 4X 버퍼 조성이라고 알고 있습니다. 열처리를 안한 샘플은 시료30uL에 샘플버퍼 10uL을 섞어 열처리 없이 로딩하였고 마지막 well에는 베타멀캅토에탄올 1+샘플버퍼 9uL + 시료 30 uL을 섞어 열처리 후 로딩하였습니다.
동시에 SDS-PAGE와 영동을 시킨적은 없지만 같은 조건에서 따로 확인한 적은 있습니다.
본래 이 정도 위치에서 나오기에 카제인 gel에서도 비슷하게 나올 줄 알았는데, 위쪽에 머물러서 의문입니다. 혹은 running buffer가 문제일까요? 런닝은 4도씨에서 진행했는데 버퍼는 실온에 있던 것을 사용하였습니다.
SDS-PAGE, zymography를 동일 시료로 확인을 해 보세요.
정상적으로 zymography gel에서 전기영동이 진행되었는지 확인이 필요할 것
같습니다.
위에 있는 활성 band가 아래까지 내려 오지 않은 것으로 보입니다.
activation은 몇 시간 정도 했나요?
sample에 염이 많은 것 같고 마커를 보면 전기영동은 문제가 없어 보입니다.
-
레벨1
팬더판
(대학생)
-
21.04.12 11:32
-SDS-PAGE, zymography 진행시 동일 시료였습니다(다만 동시에 진행하지는 않았습니다).
-activation은 18시간 동안 37도에서 진행했습니다
-혹시 샘플에 염이 많다는 것은 어떻게 판단하셨나요?? 현재 시료가 TSB배지에서 키운 미생물 조효소를 동결건조한 후 10k centrifugal filter를 이용하여 대략의 정제만 한 상태입니다. 염이 많다면 투석을 하면 나아질까요?
- SDS-PAGE, zymography 진행시 동일 시료였습니다(다만 동시에 진행하지는
않았습니다).
: 동일 시료라는 뜻이 동일 sample buffer를 사용해야 한다는 뜻입니다.
SDS-PAGE도 zymography용 sample buffer를 사용해서 진행했나요?
- activation은 18시간 동안 37도에서 진행했습니다
: 활성이 약한 경우 48시간 까지 진행하는 경우도 있습니다.
- 혹시 샘플에 염이 많다는 것은 어떻게 판단하셨나요??
: sample에 염이 많은 경우 BP line을 보면 퍼져서 내려갑니다.
- 현재 시료가 TSB배지에서 키운 미생물 조효소를 동결건조한 후 10k
centrifugal filter를 이용하여 대략의 정제만 한 상태입니다.
: UF 사용시 buffer나 멸균수로 최소 5번 정도 washing하면 탈염이 됩니다.