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 전체 > Cell Biology > Viability
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질문 MTT 고수님들 한 번만 읽어주세요.......!!!!!!!!!!!!!
알hertz912(일반인)  | 04.05 17:17
첨부파일 파일첨부: OD(570nm).PNG (125 KB)
이미지 첨부파일

안녕하십니까, 

현재 Schwann cell line을 가지고서 MTT 실험을 진행하는 중인데, 재현도 안되고 조건이 안잡혀서 몇 개월째 묶여 있습니다..

세포는 1월~4월 진행할 때 매번 2.0x10⁴/well을 깔아주었고, MTT는 10ul/well (0.5mg/ml)을 처리했습니다.

그런데 보시다시피 OD값이 1,2월은 1.0으로 잘 나오고 결과도 원하는대로 나오다가 점점 다른 실험을 추가하면서 반복할수록 50mM 처리한 그룹에서 컨트롤과 거의 차이가 없이 나옵니다..

5.6mM은 control이고 positive control로 H₂O₂ 1mM도 처리해서 보는 중인데 들쑥날쑥하지만 H₂O₂ 처리한 곳에서는 비교적 viability가 떨어진다고 보고 있습니다..

sigma MTT를 이용하고 있고 저는 media에 녹여서 사용 중입니다.

사실 sigma 시트지에서는 정확한 프로토콜이 적혀있지 않아 여기저기  참고해서 진행중인게 
기존 미디어들이 있는 상태에서 미디어 새로 바꾸지 않고 MTT 처리 후 37℃에서 3시간 incubation하고, DMSO로 교체해준 뒤 570nm에서 읽고 있습니다.

세포 계대시에도 Trypsin, EDTA는 쓰지 않고 파이펫을 이용한 물리적으로 떼는 세포이다보니 PBS 세척이나, 미디어 교체등은 최대한 안했습니다..

궁금한것은 같은 양의 세포를 깔아서 사진으로 남겨둘 때 크게 세포들 간의 차이는 없어보이는데 OD값이 저렇게 확연히 차이가 날 수 있을까요?..
제 테크닉적인 문제인거겠죠?..

primary cell이 아닌 cell line schwann cell을 이용해서는 viability를 많이들 안 본 것 같아서 이 곳에 글 남기게 되었습니다ㅠㅠ
 

첨부파일은 제가 1월~4월까지 진행한 MTT raw data입니다. 

혹시 추가로 조언 해주 실게 있다면 거침없이 남겨주세요!

감사합니다,,!

#MTT
 
#Cell viability
 
#Schwann cell
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  04.05 19:00  

세포에는 문제가 없나요?

3월 부터 세포가 변한것 같습니다.

무처리군을 여러개 했을 때 MTT값은 어느정도 균일하게 나오나요?

알hertz912  |  04.06 17:44  

안녕하세요 speed님,

키우고 있는 세포의 경우 얇고 긴 모양인데 3번 이상 계대를 하다보면 세포모양에 많이 변화가 생기는 것 같아 혹시나 세포 특성에도 영향이 끼칠까봐 1월부터 매번 새로운 세포들을 풀어서 한 두번 계대를 한 후 진행한 실험들 입니다..
사실 1월 MTT 실험시 풀었던 세포를 최근 4월 실험에서도 풀어서 진행했지만 같지 않습니다..


세포가 상태가 안 좋았을까요... 세포 얼렸던 과정들에서는 딱히 변한게 하나도 없었습니다.

대왕개구리SPEED  |  04.06 18:45  

과정에 아무런 문제가 없었다 하더라도 결과가 이상하면 cell 문제를 의심해

봐야 합니다.

처리군 보다 무처리군에서 예전과 동일 세포수, 동일 기간 배양한 후  실험해서

동일 MTT 값이 나오는지 확인해 보세요.

알hertz912  |  04.08 14:09  

SPEED님 MTT incubation 시간에 관해서도 궁금한데요 ,

제가 현재 사용 중인 cell line으로 다른 논문에서 진행할 때는 MTT를 3시간 incubation해서 사용했기에 저도 3시간으로 진행했습니다.

그런데 이번에 세포 양도, incubation시간도 다시 저희 조건에 더 맞게 조절중인데, 옆에 계신 선생님은 incubation 시간을 1시간, 3시간, 5시간을 해보라고, MTT를 넣으면 cell에 더 안 좋게끔 만들자?라고 표현을 하시는데

제가 알기로는 MTT를 넣으면 그냥 세포 안에 있는 dehydrogenase에 의해 환원되는 걸로 viability를 보는 것일 뿐이지, 처리한다고 세포가 더 안 좋아져서 그로 인해 viability 영향을 더 끼친다는 것도 맞는 말 인가요..?

제 설명을 잘 이해하셨을지 모르겠지만 답해주시면 감사하겠습니다..!

대왕개구리SPEED  |  04.08 14:15  

시간별로 처리하는 것은 cell 수 대비 실험 초기에 test 해볼 필요는 있습니다.

현재 현상은 시간 문제는 아닌것으로 보이고 viability를 보는 것이 cell에

좋고 안좋고한 문제는 없습니다.

ahffkahffk  |  04.09 04:49   

cell line schwann cell 을 사용하신다고 하셨는데

저 셀이 혹시 직접 isolation 해서 팔고 있는 셀인가요?

혹시 그렇다면 반복되는 계대배양으로 세포가 노화 되었을 것으로 추정 됩니다. 

Immortalized 된 셀라인이 아니라면 생각 해보셔야 할 문제 일듯 싶습니다. 

MTT 라는 실험 자체가 mitochondria 기능 을 보는것이기 때문에 노화 된 세포에서는 당연히 mitochondira 기능 자체에도 문제가 생기지요.

혹시 Starvation 을 통해서 세포를 synchronize 한 뒤에 해보실 생각은 없으신가요?

 

Hi solution  |  04.09 05:54   

개인적인 견해입니다. 

MTT를 가지고 몇개월 시간을 소비하고 계시는 것은 조금 비효율적인것 같습니다. 일단은 MTT로 데이터가 안나오면 가격이 조금 비싸지만, CCK-8 을 사용해 보세요. 훨씬 일관적인 데이터를 얻으실수 있을것입니다. 

MTT가 상대적으로 감도가 떨어지고, 약간의 조건 차이로 결과가 잘 안나오는 경우가 종종 있습니다.

일단은 데이터가 나와야 다음 실험으로 진행을 하실수 있으실거라 생각되기 때문에, 가장 간단하게 직접적으로 Cell counting 을 일단 진행하시는 걸 추천합니다. 

아주 간단합니다. google 에 찾아보시면 됩니다. 비용도 거의 발생하지 않아요.

일단 눈으로 직접 어떤 패턴을 보이는지를 아시는게 가장 중요합니다. 그래야 다음 실험을 계획 하실수 있고, 시간을 줄일수 있습니다. 

 

 

 

 

 

알hertz912  |  04.09 11:23  

ahffkahffk님,

Immortalized cell line을 쓰고 있습니다.. 그래서 이런 글을 올리게 되었습니다..이 cell line의 경우 한 번 풀어서 오래 유지하고 키우면 처음 풀었을 때와 모양이 달라지는데, 사실 연구실 자체가 신경관련 실험실도 아니다보니 이런 현상이 전체적인 결과에 영향을 미치진 않을까 걱정되서, MTT 진행 할 때마다 세포를 풀어서 안정화시킨 후 진행을 해왔습니다..

Passage는 최고 오래된 거는 20정도이고, 다른 랩에서 같은 셀라인을 이용한 경우 30~35정도를 썼다고 하기도 합니다. (MTT실험은 아니고 그냥 셀라인만 봤을 때)
 

테크니션의 문제인 것 같습니다 아무래도..ㅠㅠ

알hertz912  |  04.09 11:26  

Hi soultion님..

저는 작년 9월~12월까지 CCK-8으로 진행을 했는데 저희가 더 stress 상황을 주더라도 viability가 증가했지 떨어지질 않았습니다..
positive control로 H₂O₂를 썼을 때는 잘 떨어지지만 결과 자체가 저희가 예상한 것으로 전혀 나오지 않아 같은 셀라인에서는 무엇을 썼나 찾아본 결과 MTT를 진행해서 올해 초부터 진행 중인데 그나마 이 테스트에서는 큰 차이는 아니지만 경향이 나오다가 같은 조건에서 반복실험을 하고 추가적으로 확인할 수록 OD값이 확 떨어지고 있어서 큰일입니다....

viability 실험만 지금 6개월 넘게 진행하다보니 남은 멘탈이 산산조각나고 있네요....ㅎㅎ

알hbond  |  04.10 06:52  

저라면 plate reader를 먼저 점검하겠습니다. OD가 점점 줄어들었고, 4월달의 데이타는 거의 0.5-0.6 정도로 모든 데이타가 비슷한 것으로 봐서 렌즈가 오염된게 아닌가 의심이 됩니다. 96 well plate에 그냥 실험실에서 쓰시는 dye를 dilution 시켜서 쭉 깔아놓고, 한 번 찍어보세요. 세포실험도 아니고, 화학약품인 dye를 dilution 시켰는데도 데이타가 일정하게 떨어지지 않는다면, 기계가 오염된 것을 의심해 볼 필요가 있습니다. OD 측정시 plate 뚜껑을 덮고 찍으시나요? plate reader를 사용하시는 분들이 다들 깔끔하게 사용하시는지, 그렇지 않다면 더욱 오염의 확률이 큽니다. 한 번 점검해 보세요. 만일 오염이 되었다면 내부를 청소해 주셔야 합니다.

 

알교닝  |  04.10 16:42  
저는 일반 cancer cell이었지만 인히비터 처리해도 cck로 viabilty가 늘기만해서 mtt 로 갈아탔었습니다. LDH? 라는 것도 있다고만 보고 시도는 안해보았는데 참고해보세요!

당연하시겠지만 이전과 media나 serum 브랜드 조성, dish 브랜드나 컨디션도 같은 조건이신거죠?
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