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질문 PCR 실험에서 DNA Band 자체가 나오지 않네요
알김개불(대학생)  | 04.04 01:41

실험실습을 하면서 쥐 DNA를 이용해서 PCR를 했는데 전기영동후에 DNA Band가 아예 보이지 않는데 그 원인을 모르겠네요.

같은 방식으로 진행한 다른 사람들은 결과가 다 나왔습니다. 실험의 사용된 용액에는 문제가 없는데 만약 DNA밴드가 보이지 않는다면 어떤 점에서 잘못된 것일까요? 혹시 어떠한 용액을 많이 넣거나 적게넣으면 DNA 밴드가 아예 보이지 않을까요?

실험과정은 

준비한 쥐 tail을 

Hot solution 75ul 

100도에서 45분간 가열

Ice에 식힘 

cold solution 75ul

centrifuge 4000rpm, 3min 

 

PCR 

PCR MIXTURE :prime Taq premix 10ul

3'D.W: 6ul

primer MIX; 2ul

PCR tubedp PCR mixture를 18ul씩 넣는다

DNA extracted from tailf를 추가한다

PCR실행한다 

 

2.8%의 agarose gel 준비 

삼각플라스크에 1.12g(Agarose)/40ml(1xTAE Buffer)를 섞고, 입구를 막은 후 전자레인지로 2분간 가열

삼각플라스트를 약 60도 식힌후, BANDI-GREEN 4ul을 넣는다. 

Agarose gel를 tray에 붓고, well comb을 끼워 20-30분간 굳힌다 

 

굳은 agarose gel을 1x TAE Buffer로 채워진 gel running tank에 위치시킨다

첫번째 well에 DNA ladder 5ul를 로딩한다

PCR sample를 순서대로 10ul씩 로딩한다

Running-100V 25-30min 

UV visualizer를 이용하여 DNA band를 관찰하고 gel 이미지를 촬영한다 

#PCR
 
#전기영동
 
#DNA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  04.04 10:48  

primer band는 보이나요?

DNA prep.과 PCR 중 어느 단계에서 문제가 있는 확인해야 할 것 같습니다.

fast prep.이 아닌 정상 protocol로 DNA를 분리 후 PCR을 한번 해보세요.

알가나다라마마마  |  04.05 11:15  

쥐를 다루는 많은 연구실에서 쓰는 Dirty Prep을 이용한 Genotyping을 하시는 것으로 판단됩니다. 하시는 실험의 원리는 구글에 Mouse Tail DNA dirty prep 치시면 자세한 프로토콜과 설명이 있을 겁니다.

 

다른 사람들 다 되는데 본인만 안되시는 거라면

 

1. 다른 사람들과 본인이 사용하는 Primer가 같나요? Dirty Prep로 DNA를 뽑을 경우, Primer 에 따라 PCR이 잘 안되는 경우가 있습니다.

 

2. 끓인 후 Buffer 2를 넣고선 둘을 voltexing 하셨나요? voltexing 후 centrifuge를 해야 바닥으로 남은 tissue를 비롯한 dirty debris를 잘 내릴 수 있습니다.

 

3. PCR을 할 때 쓰는 상층액이 끈적임이 심한가요? 2번에 이어지는 내용으로, 끈적임이 심한건 Buffer 2를 넣고 정상적으로 DNA가 분리가 잘 되지 않을 때입니다.

 

4. PCR 할때 total 18ul인데, premixture가 10ul 인거는 제품회사가 요구하는 사항과 같나요? 보통 genotyping 할 때 쓰는 PCR premixture는 2x 혹은 5x 로 농축된 애들인데, 18 중에 10은 이 둘다 아닙니다만... 

 

지금 생각나는 건 이정도네요. 실험 잘 되시길 바랍니다. 

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